本发明涉及生物，具体涉及一种用于肺腺癌诊断、预后评估的标志物及其应用。
背景技术：
1、肺腺癌是全球最常见的肺癌亚型，约占所有肺癌病例的40％。随着诊断、手术、放疗、免疫治疗和分子治疗的进步，肺腺癌患者的临床结果显著改善。然而，肺腺癌患者的5年生存率仍处于较低水平。且肺腺癌的发现大多在晚期，患者在进行根治性手术之后仍然有肿瘤复发的现象。目前，肺腺癌诊断手段包括影像学检查，肺癌细胞学或组织学、痰液细胞学和血清学肿瘤标志物等，但都对复发监测及预后判定敏感性及特异性欠佳，往往存在滞后性且不能在多种标本中应用。即使是近年新兴的液体活检技术，就现阶段而言缺乏标准化的检测方法、成本高昂以及临界水平的不确定性等问题，限制了其在常规临床实践中的广泛使用。因此，有必要提供一种有效、简单的能够准确评估复发风险及预后判定的生物标志物。
2、肺腺癌发生发展及复发转移是一个多因素和多基因变异的累积过程。dna甲基化作为最常见的表观遗传修饰之一，在肺腺癌发生和进展中起重要作用，广泛参与肺腺癌诸多生物学过程调控，贯穿于肿瘤发生发展的全过程。因此，生物标志物具体的甲基化位点在肺腺癌的临床应用也越来越受关注，但总体而言，dna甲基化标志物在肺腺癌复发监测及预后判定中的探索仍需进一步深入研究。
3、有报道富含半胱氨酸和酪氨酸1(cyyr1)参与人星形胶质细胞中胆固醇稳态和淀粉样病变，但在肺腺癌在内的肿瘤中的作用依旧未知。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供cyyr1基因作为肺腺癌诊断、预后评估的标志物的用途及其应用。
2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
3、本发明提供了一种用于肺腺癌诊断、预后评估的标志物，所述标志物为cyyr1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cyyr1基因在肺腺癌组织中的表达水平明显低于对应的癌旁组织，且所述cyyr1基因的表达水平与肺腺癌的预后效果正相关，与肺腺癌的复发风险负相关，可以通过检测cyyr1基因的表达水平进行肺腺癌诊断和肺腺癌的预后判断、复发风险评估和监测。
4、进一步地，所述标志物为cyyr1基因的启动子cpg聚集区域，其核苷酸序列如seqid no.2所示，所述cyyr1基因的启动子cpg聚集区域的甲基化水平在肺腺癌组织中明显高于癌旁组织，且所述cyyr1基因的启动子cpg聚集区域的甲基化水平与肺腺癌的预后效果负相关，与肺腺癌的复发风险正相关，可以通过检测所述cyyr1基因的启动子cpg聚集区域的甲基化水平进行肺腺癌诊断和肺腺癌的预后判断、复发风险评估和监测。
5、本发明还提供了实时定量pcr法检测cyyr1基因表达的特异性引物，所述引物为：
6、上游引物seq id no.3：5’-ccacgccctactgttgctcc-3’；
7、下游引物seq id no.4：5’-tcatgcacatgcagatgcatat-3’。
8、本发明还提供了核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物，所述引物序列为:
9、上游引物seq id no.5：5’-aggaagagaggaaatgtgagtttgggtggttaag-3’；
10、下游引物seq id no.6：5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctcattacctaaaaaaccttccaaaaa-3’。
11、本发明还提供了msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物，所述引物包括:
12、启动子甲基化状态的特异性引物：
13、上游引物seq id no.7：5’-cgtttgagcgtagtggggc-3’；
14、下游引物seq id no.8：5’-tcccgaaccaacgactacg-3’；
15、启动子非甲基化状态的特异性引物：
16、上游引物seq id no.9：5’-tgtgtttgagtgtagtggggt-3’；
17、下游引物seq id no.10：5’-catcccaaaccaacaactaca-3’。
18、本发明还提供了上述肺腺癌诊断、预后评估的标志物、上述实时定量pcr法检测cyyr1基因表达的特异性引物、上述核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物、上述msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物在制备肺腺癌诊断、预后评估的产品中的应用。
19、一种用于肺腺癌诊断、预后评估的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测cyyr1基因表达水平的试剂、用于检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的试剂中的至少之一。
20、进一步地，所述用于检测cyyr1基因表达水平的试剂包括实时定量pcr法检测cyyr1基因表达的特异性引物，所述引物为：
21、上游引物seq id no.3：5’-ccacgccctactgttgctcc-3’；
22、下游引物seq id no.4：5’-tcatgcacatgcagatgcatat-3’。
23、进一步地，所述用于检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的试剂包括核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物、msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物中的至少之一。
24、进一步地，核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物为:
25、上游引物seq id no.5：5’-aggaagagaggaaatgtgagtttgggtggttaag-3’；
26、下游引物seq id no.6：5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctcattacctaaaaaaccttccaaaaa-3’。
27、进一步地，所述msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物包括:
28、启动子甲基化状态的特异性引物：
29、上游引物seq id no.7：5’-cgtttgagcgtagtggggc-3’；
30、下游引物seq id no.8：5’-tcccgaaccaacgactacg-3’；
31、启动子非甲基化状态的特异性引物：
32、上游引物seq id no.9：5’-tgtgtttgagtgtagtggggt-3’；
33、下游引物seq id no.10：5’-catcccaaaccaacaactaca-3’。
34、本发明的发明过程及思路为：
35、发明人利用tcga在线数据库和实验室收集的配对肺腺癌和癌旁样本检测结果，进行了cyyr1在肺腺癌中的表达情况分析，结果表明cyyr1在肺腺癌中的表达明显低于癌旁组织；进一步地，发明人对cyyr1表达与甲基化的相关性进行了分析，结果表明cyyr1在肺腺癌中呈启动子高甲基化状态，其表达水平与甲基化水平呈负相关。进一步地，发明人对cyyr1在肺腺癌中的生存曲线进行了分析，结果表明，cyyr1的低表达与肺腺癌患者的不良预后相关。基于此，发明人确定cyyr1可以作为肺腺癌的生物标志物，用于肺腺癌的诊断和预后评价。进一步地，发明人分析了cyyr1启动子区域cpg岛，确定了cyyr1启动子甲基化区域，发明人针对cyyr1启动子甲基化区域设计了特异性引物，飞行质谱检测结果表明，特异性引物可以与cyyr1基因dna甲基化位点序列特异性结合，灵敏、快速、准确地检测cyyr1的甲基化水平，能够有效区分肺腺癌组织及正常肺组织，对于肺腺癌患者能够提示复发风险及判定预后。另外，发明人对肺腺癌患者的肺腺癌组织、痰液、细胞的dna样本进行msp甲基化检测，发现肺腺癌患者以上dna样本甲基化均升高，能够准确辨别肺腺癌患者。最后，申请人构建了稳定过表达cyyr1的肺腺癌细胞株，体外细胞实验结果证实过表达cyyr1可抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，体内实验证实，过表达cyyr1可抑制肺腺癌细胞体内增殖及转移能力。
36、本发明的有益效果在于：本发明公开了cyyr1基因作为肺腺癌诊断、预后评估的生物标志物的用途以及其在制备肺腺癌诊断、预后评估的产品中的应用。本发明通过tcga在线数据库分析和实验验证确定，cyyr1在肺腺癌中的表达明显低于癌旁组织，其表达水平与肺腺癌的预后效果正相关、与肺腺癌的复发风险负相关，并且，cyyr1的表达水平与其启动子区域的甲基化水平呈负相关，通过检测cyyr1基因表达水平以及检测其启动子cpg聚集区域的甲基化水平，可以进行肺腺癌诊断和肺腺癌的预后判断、复发风险评估和监测，这为肺腺癌的诊断和预后评估提供了新的策略和思路。本发明还公开了实时定量pcr法检测cyyr1基因表达的特异性引物，所述引物为：上游引物seq id no.3，下游引物seq id no.4，其可以与cyyr1基因特异性结合，灵敏、快速、准确地检测cyyr1的表达水平，能够有效区分肺腺癌组织及正常肺组织，对于肺腺癌患者能够提示复发风险及判定预后。本发明还公开了核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物，所述引物序列为上游引物seq id no.5，下游引物seq id no.6，其可以与cyyr1基因启动子区域cpg岛的甲基化位点序列特异性结合，灵敏、快速、准确地检测cyyr1启动子区域cpg岛的甲基化水平，能够有效区分肺腺癌组织及正常肺组织，对于肺腺癌患者能够提示复发风险及判定预后。本发明还公开了msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物包括:启动子甲基化状态的特异性引物：上游引物seq id no.7，下游引物seq id no.8，启动子非甲基化状态的特异性引物：上游引物seq id no.9，下游引物seq id no.10，其可以与cyyr1基因启动子区域cpg岛的甲基化和非甲基化位点序列特异性结合，灵敏、快速、准确地检测cyyr1启动子区域cpg岛的甲基化水平，能够灵敏、快速、准确地检测出肺腺癌患者的肺腺癌组织、痰液、细胞的dna样本中cyyr1启动子区域cpg岛的甲基化水平，能够准确辨别肺腺癌患者，以及能够提示肺腺癌患者的复发风险和预后效果判定。
1.一种用于肺腺癌诊断、预后评估的标志物，其特征在于，所述标志物为cyyr1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cyyr1基因在肺腺癌组织中的表达水平明显低于对应的癌旁组织，且所述cyyr1基因的表达水平与肺腺癌的预后效果正相关，与肺腺癌的复发风险负相关，可以通过检测cyyr1基因的表达水平进行肺腺癌诊断和肺腺癌的预后判断、复发风险评估和监测。
2.根据权利要求1所述的用于肺腺癌诊断、预后评估的标志物，其特征在于，所述标志物为cyyr1基因的启动子cpg聚集区域，其核苷酸序列如seq id no.2所示，所述cyyr1基因的启动子cpg聚集区域的甲基化水平在肺腺癌组织中明显高于癌旁组织，且所述cyyr1基因的启动子cpg聚集区域的甲基化水平与肺腺癌的预后效果负相关，与肺腺癌的复发风险正相关，可以通过检测所述cyyr1基因的启动子cpg聚集区域的甲基化水平进行肺腺癌诊断和肺腺癌的预后判断、复发风险评估和监测。
3.实时定量pcr法检测cyyr1基因表达的特异性引物，其特征在于，所述引物为：
4.核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物，其特征在于，所述引物序列为:
5.msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物，其特征在于，所述引物包括:
6.权利要求1-2任一项所述的用于肺腺癌诊断、预后评估的标志物、权利要求3所述的实时定量pcr法检测cyyr1基因表达的特异性引物、权利要求4所述的核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物、权利要求5所述的msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物在制备肺腺癌诊断、预后评估的产品中的应用。
7.一种用于肺腺癌诊断、预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测cyyr1基因表达水平的试剂、用于检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的试剂中的至少之一。
8.根据权利要求7所述的用于肺腺癌诊断、预后评估的试剂盒，其特征在于，所述用于检测cyyr1基因表达水平的试剂包括实时定量pcr法检测cyyr1基因表达的特异性引物，所述引物为：
9.根据权利要求7所述的用于肺腺癌诊断、预后评估的试剂盒，其特征在于，所述用于检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的试剂包括核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物、msp法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化水平的特异性引物中的至少之一。
10.根据权利要求9所述的用于肺腺癌诊断、预后评估的试剂盒，其特征在于，核酸飞行质谱法检测cyyr1基因的启动子cpg聚集区域甲基化的特异性引物为:
