本发明涉及多肽合成，具体涉及一种带侧链lys氨基酸的合成方法及其在司美格鲁肽的应用。
背景技术：
1、司美格鲁肽，英文名称semaglutide，是一种新型长效胰高血糖素样肽-1（glp-1）类似物，通过刺激胰岛素分泌和降低胰高血糖素分泌的机制来降低血糖。其结构式如下：
2、
3、从结构上看，司美格鲁肽n端第20位lys侧链氨基经aeea、glu、十八烷二酸修饰，增强了司美格鲁肽的亲水性，提高与蛋白的结合率，从而达到长效的目的。现有技术中司美格鲁肽的侧链一般是先事先合成侧链再与第20位带保护基lys氨基酸偶联，例如中国专利公开文献（cn110372785a）采用了ste(tbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea-oh、和fmoc-thr（tbu）-phe-thr（tbu）-ser（tbu）-asp（otbu）-val-oh两个片段，其中lys20采用了fmoc-lys(alloc)-oh，脱出alloc保护基时需要使用pd(pph3)4，引入了重金属pd，后续需要进行pd残留检测等；另有中国公开专利文献（cn112028986a）公开在第20位lys采用dde-lys(fmoc)-oh正交保护，但需要使用具有基因毒性得水合肼脱除dde保护基。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种带侧链lys氨基酸的合成方法及其在司美格鲁肽的应用，它能够避免了pd重金属和水合肼等基因毒性物质的引入。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
3、带侧链lys氨基酸的合成方法，包括如下步骤：
4、s1、以tbuo-ste-oh为起始原料经活化反应得到tbuo-ste-osu；
5、s2、使步骤s1的tbuo-ste-osu与h-glu-otbu进行缩合反应得到tbuo-ste-glu-otbu；
6、s3、使步骤s2的tbuo-ste-glu-otbu进行活化反应得到tbuo-ste-glu(osu)-otbu；
7、s4、使步骤s3的tbuo-ste-glu(osu)-otbu与h-aeea-aeea-oh进行缩合反应得到tbuo-ste-glu(aeea-aeea-oh)-otbu；
8、s5、使步骤s4的tbuo-ste-glu(aeea-aeea-oh)-otbu进行活化反应得到tbuo-ste-glu(aeea-aeea-osu)-otbu；
9、s6、使步骤s5的tbuo-ste-glu(aeea-aeea-osu)-otbu与fmoc-lys-oh•hcl进行缩合反应得到fmoc-lys(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh。
10、优选地，所述步骤s1的具体步骤如下：tbuo-ste-oh和活化剂搅拌溶解在有机溶剂中并降温得到活化液中；缩合剂溶解在有机溶剂后滴加到活化液中搅拌反应；反应结束后过滤、洗涤收集有机相；浓缩有机相，再进行打浆、过滤、洗涤，收集滤饼干燥处理得到固体tbuo-ste-osu。
11、优选地，所述步骤s2的具体步骤如下：h-glu-otbu溶解在有机溶剂中并用碱调节ph，加入tbuo-ste-osu搅拌反应；反应结束后酸洗收集有机相，加入无水硫酸钠干燥、过滤得到固体tbuo-ste-glu-otbu。
12、优选地，所述步骤s3的具体步骤如下：tbuo-ste-glu-otbu和活化剂搅拌溶解在有机溶剂中并降温得到活化液中；缩合剂溶解在有机溶剂后滴加到活化液中搅拌反应；反应结束后过滤、洗涤收集有机相；加入无水硫酸钠干燥、过滤，再进行打浆、过滤、洗涤，收集滤饼干燥处理得到固体tbuo-ste-glu(osu)-otbu。
13、优选地，所述步骤s4的具体步骤如下：tbuo-ste-glu(osu)-otbu溶解在有机溶剂中并用碱调节ph，滴加溶解后的h-aeea-aeea-oh，搅拌反应；反应结束后收集有机相加入无水硫酸钠干燥、过滤，在液态饱和烷烃溶解并冰浴结晶，重复离心除去上清液，干燥得到tbuo-ste-glu(aeea-aeea-oh)-otbu。
14、优选地，所述步骤s5的具体步骤如下：tbuo-ste-glu(aeea-aeea-oh)-otbu和活化剂搅拌溶解在有机溶剂中并降温得到活化液中；缩合剂溶解在有机溶剂后滴加到活化液中搅拌反应；反应结束后过滤、洗涤收集有机相；加入无水硫酸钠干燥、过滤，再进行打浆、过滤、洗涤，收集滤饼干燥处理得到固体tbuo-ste-glu(aeea-aeea-osu)-otbu。
15、优选地，所述步骤s6的具体步骤如下：tbuo-ste-glu(aeea-aeea-osu)-otbu溶解在有机溶剂中并用碱调节ph，加入fmoc-lys-oh•hcl搅拌反应；反应结束后酸洗收集有机相；加入无水硫酸钠干燥、过滤，然后加入有机溶剂溶解进行柱层析纯化和洗脱，得油状产物fmoc-lys(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh。
16、优选地，所述步骤s1、s3和s5的活化反应中采用活化剂、缩合剂及有机溶剂，其中活化剂为hosu或hobt，缩合剂为dcc、dic或edci，所述有机溶剂为dcm、thf、ea和dmf中的一种或多种，各步骤的活化底物与活化剂的摩尔比为1∶0.9-1.3，各步骤的活化底物与缩合剂的摩尔比为1∶1.1-1.5。另，所述步骤s2、s4和s6的缩合反应中采用碱及有机溶剂，其中碱为diea、nmm或dmap，所述有机溶剂为dcm、thf、ea和dmf中的一种或多种。
17、本发明还提供带侧链lys氨基酸在司美格鲁肽的应用，采用上述合成方法制得带侧链lys氨基酸fmoc-lys(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh，以所述带侧链lys氨基酸作为第20位氨基酸参与司美格鲁肽肽序合成。
18、其中：先固相合成第21-31位氨基酸的第一肽段树脂，fmoc-lys(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh进行活化后加入第一肽段树脂进行偶联反应；反应结束后洗涤、脱保护反应后再重复洗涤，得到h-lys20(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)glu(otbu)21-phe22-ile23-ala24-trp(boc)25-leu26-val27-arg(pbf)28-gly29-arg(pbf)30-gly31-树脂。
19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20、本发明以tbuo-ste-oh为起始原料采用液相合成带侧链lys氨基酸fmoc-lys(ste(tbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh，氨基酸采用fmoc-lys-oh•hcl，有效降低了物料成本，避免了pd重金属和水合肼等基因毒性物质的引入，同时解决了直接偶联十八烷二酸偶联不完全的问题。
1.带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤s1的具体步骤如下：tbuo-ste-oh和活化剂搅拌溶解在有机溶剂中并降温得到活化液中；缩合剂溶解在有机溶剂后滴加到活化液中搅拌反应；反应结束后过滤、洗涤收集有机相；浓缩有机相，再进行打浆、过滤、洗涤，收集滤饼干燥处理得到固体tbuo-ste-osu。
3.根据权利要求1所述的带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤s2的具体步骤如下：h-glu-otbu溶解在有机溶剂中并用碱调节ph，加入tbuo-ste-osu搅拌反应；反应结束后酸洗收集有机相，加入无水硫酸钠干燥、过滤得到固体tbuo-ste-glu-otbu。
4.根据权利要求1所述的带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤s3的具体步骤如下：tbuo-ste-glu-otbu和活化剂搅拌溶解在有机溶剂中并降温得到活化液中；缩合剂溶解在有机溶剂后滴加到活化液中搅拌反应；反应结束后过滤、洗涤收集有机相；加入无水硫酸钠干燥、过滤，再进行打浆、过滤、洗涤，收集滤饼干燥处理得到固体tbuo-ste-glu(osu)-otbu。
5.根据权利要求1所述的带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤s4的具体步骤如下：tbuo-ste-glu(osu)-otbu溶解在有机溶剂中并用碱调节ph，滴加溶解后的h-aeea-aeea-oh，搅拌反应；反应结束后收集有机相，加入无水硫酸钠干燥、过滤，在ea/液态饱和烷烃溶解并冰浴结晶，重复离心除去上清液，干燥得到tbuo-ste-glu(aeea-aeea-oh)-otbu。
6.根据权利要求1所述的带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤s5的具体步骤如下：tbuo-ste-glu(aeea-aeea-oh)-otbu和活化剂搅拌溶解在有机溶剂中并降温得到活化液中；缩合剂溶解在有机溶剂后滴加到活化液中搅拌反应；反应结束后过滤、洗涤收集有机相；加入无水硫酸钠干燥、过滤，再进行打浆、过滤、洗涤，收集滤饼干燥处理得到固体tbuo-ste-glu(aeea-aeea-osu)-otbu。
7.根据权利要求1所述的带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤s6的具体步骤如下：tbuo-ste-glu(aeea-aeea-osu)-otbu溶解在有机溶剂中并用碱调节ph，加入fmoc-lys-oh•hcl搅拌反应；反应结束后酸洗收集有机相；加入无水硫酸钠干燥、过滤，然后加入有机溶剂溶解进行柱层析纯化和洗脱，得油状产物fmoc-lys(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh。
8.根据权利要求1所述的带侧链lys氨基酸的合成方法，其特征在于：所述步骤s1、s3和s5的活化反应中采用活化剂、缩合剂及有机溶剂，其中活化剂为hosu或hobt，缩合剂为dcc、dic或edci，所述有机溶剂为dcm、thf、ea和dmf中的一种或多种。
9.带侧链lys氨基酸在司美格鲁肽的应用，其特征在于：采用如权利要求1至8任一项所述的合成方法制得带侧链lys氨基酸fmoc-lys(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh，以所述带侧链lys氨基酸作为第20位氨基酸参与司美格鲁肽肽序合成。
10.根据权利要求9所述的带侧链lys氨基酸在司美格鲁肽的应用，其特征在于：先固相合成第21-31位氨基酸的第一肽段树脂，fmoc-lys(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)-oh进行活化后加入第一肽段树脂进行偶联反应；反应结束后洗涤、脱保护反应后再重复洗涤，得到h-lys20(ste(otbu)-γ-glu(otbu)-aeea-aeea)glu(otbu)21-phe22-ile23-ala24-trp(boc)25-leu26-val27-arg(pbf)28-gly29-arg(pbf)30-gly31-树脂。
