本发明涉及生物免疫，特别是涉及一种asfvp11.5蛋白b细胞表位的多肽、单克隆抗体和应用。
背景技术：
1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus,asfv)引起的一种具有出血性、高热性等特征的传染病，可以导致不同日龄和品种的家猪、野猪感染，死亡率可高达100％。被世界动物卫生组织(world organizationforanimal health,woah)列为需要通报的动物重大烈性传染病，被中国列为一类动物疫病。非洲猪瘟危害大，传播途径广，自1921年在肯尼亚出现以来，一直在向全球不断的扩散蔓延，给世界各国的生猪养殖业和生态环境造成了巨大的损害。asf至今已有上百年历史，目前仍未有可供全球推广使用的商业化疫苗和抗病毒药物。现今对构成非洲猪瘟病毒蛋白的结构和功能研究的认知仍然有限，导致对非洲猪瘟病毒检测和疫苗研制困难重重。因此更多的研究非洲猪瘟病毒蛋白的结构和功能对于asfv检测试剂和疫苗研制以及预防非洲猪瘟具有重要作用。
2、asfv拥有170-194kb的大型线性双链dna(dsdna)基因组，编码150多种蛋白质。尽管已经从病毒体中鉴定出多达68种结构蛋白，但大多数蛋白的功能尚不清楚。asfv病毒体具有独特的多层结构，细胞内病毒体由核苷(第一层)，内核壳(第二层)，内膜(第三层)和衣壳(第四层)构成。细胞外病毒体具有额外的外部包膜(第五层)。细胞内和细胞外asfv病毒体都具有传染性。构成病毒颗粒的结构蛋白分布在这些多层结构中，并在病毒感染中发挥各种作用。病毒结构蛋白抗原特性的鉴定对于理解病毒与宿主之间的相互作用是必不可少的，对于改进asfv血清学诊断和设计亚单位疫苗或病毒载体疫苗是至关重要的。目前，asfv具有25个基因型，某些基因的遗传多样性和抗原多样性是造成缺乏针对这种致死性猪疾病的交叉保护疫苗这种情况的主要原因之一。抗原性结构蛋白的多样性也可能会对asfv感染的可靠诊断产生巨大影响。
3、为了深入研究抗原性结构蛋白在病毒感染中发挥的作用，并实现对asfv病毒感染的准确诊断，本领域仍需要更多能够识别asfv不同结构蛋白、不同抗原表位的单克隆抗体，为防治asf提供新方向和新思路。asfvp11.5蛋白又称为pa137r，由orfa137r基因编码，是构成非洲猪瘟病毒的一种结构蛋白，分子质量约为16.9kda，产生于病毒感染的晚期，为晚期蛋白，主要定位于细胞质，且与asfv的结构蛋白p72共定位，在纯化的病毒粒子中及在病毒工厂均能检测到该蛋白。p11.5蛋白被检测到在asfv病毒粒子的衣壳层表面，它能够参与病毒粒子的组装及病毒的吸附。asfvp11.5蛋白具有高度保守性，在不同毒株的非洲猪瘟病毒之间它的核苷酸同源性为93.34％，氨基酸同源性为90.39％。asfvp11.5蛋白是asfv的重要毒力因子，并被鉴定出是具有较强免疫原性的病毒结构蛋白。因此，asfv p11.5蛋白是一个良好的靶点，用于asfv的检测和疫苗的研发都具有良好的应用前景。
4、b细胞表位是抗原分子表面的氨基酸簇，可被特异性识别并与分泌的抗体和b细胞受体结合，诱导宿主的细胞和体液免疫反应。b细胞表位的鉴定具有许多重要的生物学意义，如深化对免疫反应和自身免疫性疾病的认识，为多肽疫苗的开发和疾病诊断方法的建立提供候选表位，并有助于揭示治疗性抗体的作用机制。筛选出p11.5蛋白免疫显性表位区域，对该病的诊断和多肽疫苗的研制具有重要价值。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了一种asfvp11.5蛋白b细胞表位的多肽、单克隆抗体和应用，本发明提供的asfvp11.5蛋白单克隆抗体4a4、5h2和5b2，3个单克隆抗体能特异性识别asfv p11.5蛋白上的30iindflei37、99eiknlgips107和116nienmddl123序列区域。
2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、本发明提供了一种asfvp11.5蛋白b细胞表位的多肽，包括30iindflei37、99eiknlgips107和116nienmddl123中的一种或多种。
4、本发明还提供了一种特异性识别上述技术方案所述多肽的单克隆抗体，包括单克隆抗体4a4、单克隆抗体5h2和单克隆抗体5b2中的一种或多种；
5、所述单克隆抗体4a4的重链可变区氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.2所示；
6、所述单克隆抗体5h2的重链可变区氨基酸序列如seq id no.3所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示；
7、所述单克隆抗体5b2的重链可变区氨基酸序列如seq id no.5所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.6所示。
8、优选的，所述单克隆抗体4a4的重链可变区核苷酸序列如seq id no.7所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.8所示。
9、优选的，所述单克隆抗体5h2的重链可变区核苷酸序列如seq id no.9所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.10所示。
10、优选的，所述单克隆抗体5b2的重链可变区核苷酸序列如seq id no.11所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.12所示。
11、优选的，所述单克隆抗体4a4特异性识别asfvp11.5蛋白b细胞表位的30iindflei37。
12、优选的，所述单克隆抗体5h2特异性识别asfvp11.5蛋白b细胞表位的99eiknlgips107。
13、优选的，所述单克隆抗体5b2特异性识别asfvp11.5蛋白b细胞表位的116nienmddl123。
14、本发明还提供了上述技术方案所述的asfvp11.5蛋白b细胞表位的多肽在制备诊断、检测或预防asfv试剂中的应用。
15、本发明还提供了上述技术方案所述的单克隆抗体在制备诊断、检测或预防asfv试剂中的应用。
16、本发明的有益效果：
17、本发明提供的asfvp11.5蛋白单克隆抗体，是基于设计并构建能够大量表达主要以可溶性形式存在的p11.5蛋白。以p11.5蛋白作为免疫原免疫小鼠，利用细胞融合技术，以p11.5蛋白作为检测原，通过间接elisa，筛选得到了抗asfv p11.5蛋白的单克隆细胞株4a4、5h2和5b2，该细胞株产生的单克隆抗体可特异性识别并结合asfv p11.5蛋白上的30iindflei37、99eiknlgips107和116nienmddl123序列区域。
18、本发明将表达asfvp11.5蛋白作为免疫原免疫小鼠，结果显示获得的单克隆抗体效价高的可达1:512000，并具有良好的特异性，并利用重叠多肽方法鉴定到了抗原抗体的作用位点，多序列比对分析表明该表位是保守的，因此该单克隆抗体在检测asfv上具有良好的应用前景。
19、本发明利用原核表达系统在bl21(de3)细胞中表达p11.5蛋白。将纯化的p11.5蛋白作为免疫原，通过免疫学方法免疫balb/c小鼠，经细胞融合技术制备获得抗asfvp11.5蛋白的单克隆抗体。利用重叠多肽法根据鉴定的抗原表位区域合成9条多肽(p1～p9)，每条多肽重叠5个氨基酸残基。经peptide-elisa和dot-elisa对抗原表位鉴定，结果表明p230iindflei37、p699eiknlgips107和p7116nienmddl123，为p11.5蛋白的线性b细胞表位区域。30iindflei37和99eiknlgips107是首次报道的p11.5蛋白的线性b细胞表位，116nienmddl123比目前报道的p11.5蛋白的线性b细胞表位相比有一个更精确的定位，为进行asfv病原学和致病机理的研究及asfv病原的临床检测研究奠定了基础。
1.一种asfvp11.5蛋白b细胞表位的多肽，其特征在于，包括30iindflei37、99eiknlgips107和116nienmddl123中的一种或多种。
2.一种特异性识别权利要求1所述多肽的单克隆抗体，其特征在于，包括单克隆抗体4a4、单克隆抗体5h2和单克隆抗体5b2中的一种或多种；
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体4a4的重链可变区核苷酸序列如seq id no.7所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.8所示。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体5h2的重链可变区核苷酸序列如seq id no.9所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.10所示。
5.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体5b2的重链可变区核苷酸序列如seq id no.11所示，轻链可变区核苷酸序列如seq id no.12所示。
6.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体4a4特异性识别asfvp11.5蛋白b细胞表位的30iindflei37。
7.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体5h2特异性识别asfvp11.5蛋白b细胞表位的99eiknlgips107。
8.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体5b2特异性识别asfvp11.5蛋白b细胞表位的116nienmddl123。
9.权利要求1所述的asfv p11.5蛋白b细胞表位的多肽在制备诊断、检测或预防asfv试剂中的应用。
10.权利要求2～8任一项所述的单克隆抗体在制备诊断、检测或预防asfv试剂中的应用。
