本发明涉及细胞培养，尤其涉及一种nk细胞的体外扩增及活化方法。
背景技术：
1、免疫检查点抑制剂(ici)彻底改变了免疫肿瘤学领域，部分患者可以实现肿瘤的持久免疫控制。然而，肿瘤免疫逃避机制依然存在，如何让更多的病人获益，开发更有效的治疗方案始终面临着挑战。
2、目前，联合疗法正成为免疫肿瘤学研究的中心。这种联合疗法应该增强抗肿瘤免疫反应或靶向肿瘤免疫逃逸机制，特别是肿瘤微环境(tme)中的各种参与者。自然杀伤(nk)细胞最近处于许多免疫治疗策略的前沿，人们正在开发一些新的方法来充分利用nk细胞的抗肿瘤潜力。
3、中国专利cn104928243a公开了一种nk细胞分离、培养扩增方法，能够从外周血分离获得高活性的淋巴细胞群，体外经过一系列细胞因子的刺激，包括采用ifn-γ作为活化诱导剂，nk细胞(cd3-cd56+)得到纯化、活化和大量扩增，达到应用于临床治疗肿瘤的水平。
4、但是现有技术中的nk细胞扩增及活化效果有待进一步提升。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种nk细胞的体外扩增及活化方法，能够在体外培养条件下快速高效地得到大量高杀伤活性的nk细胞。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种nk细胞的体外扩增及活化方法，包括以下步骤：
4、s1、将外周血单核细胞与第一活化培养基、自体灭活血浆混合，培养5～10天，培养过程中补加第一活化培养基和自体灭活血浆；
5、s2、在培养体系中补加扩增培养基，培养3～8天；
6、s3、在培养体系中补加第二活化培养基，培养4～8天，得到扩增活化后的nk细胞；
7、所述第二活化培养基包含基础培养基、il-15、il-21、il-2、mica蛋白和micb蛋白。
8、优选的，所述第二活化培养基包含以下终浓度的组分：
9、40～50g/ml il-15、10～30ng/ml il-21、800～1200iu/ml il-2、10ng/ml mica蛋白和10ng/ml micb蛋白。
10、优选的，所述第一活化培养基包含基础培养基、il-15、il-21和il-2。
11、优选的，所述第一活化培养基包含以下终浓度的组分：
12、40～50g/ml il-15、10～30ng/ml il-21和800～1200iu/ml il-2；
13、和/或，所述第一活化培养基和自体灭活血浆的体积比为5～30:1。
14、优选的，所述扩增培养基包含基础培养基和il-2。
15、优选的，所述扩增培养基中il-2的终浓度为300～800iu/ml。
16、优选的，所述基础培养基为gt-t551培养基。
17、优选的，所述扩增培养基的单次补加用量为400～600ml；
18、和/或，所述第二活化培养基的单次补加用量为400～600ml；
19、和/或，所述自体灭活血浆的单次补加用量为3～8ml。
20、优选的，所述补加的频次为1～3天/次。
21、优选的，所述培养的条件为：温度36～38℃，3～8％co2。
22、本发明的有益效果：
23、本发明通过特定的活化扩增步骤，结合特殊活化培养基的使用，能够实现体外高效扩增nk细胞、并且使其活化受体nkg2d高表达，进而实现活化nk细胞，所得的产品细胞能够有效避免肿瘤细胞及其微环境带来的免疫抑制作用，提高nk细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
1.一种nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述第二活化培养基包含以下终浓度的组分：
3.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述第一活化培养基包含基础培养基、il-15、il-21和il-2。
4.根据权利要求3所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述第一活化培养基包含以下终浓度的组分：
5.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述扩增培养基包含基础培养基和il-2。
6.根据权利要求5所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述扩增培养基中il-2的终浓度为300～800iu/ml。
7.根据权利要求1～6任一项所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述基础培养基为gt-t551培养基。
8.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述扩增培养基的单次补加用量为400～600ml；
9.根据权利要求8所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述补加的频次为1～3天/次。
10.根据权利要求8或9所述的nk细胞的体外扩增及活化方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度36～38℃，3～8％co2。
