本发明涉及一种s-腺苷蛋氨酸合成酶活性提高的突变体及其应用，属于生物酶工程。
背景技术：
1、s-腺苷蛋氨酸(sam)是生物体中的一种重要代谢物，在体内参与多种生化反应，几乎在所有细胞的代谢过程中均有sam的参与。在生物体内主要作为甲基供体和参与各种转硫基、转氨基和转核糖基等生化反应，还能作为信号分子调控微生物的代谢。另外sam与多种酶的活性有关，体内sam的缺乏会影响到整个生物体的正常代谢功能。在临床上有突出的应用价值，目前主要用于肝脏、神经系统疾病、骨关节炎、抗肿瘤等方面的治疗。由于san有如上所述的生物功能和临床应用价值，目前其制备方法已经引起了越来越多的研究关注。
2、目前微生物发酵法因其便于放大、原料成本更低等优点成为工业化生产sam的主流方法，但该法在发酵周期和后期产品提取和纯化方面并不占据优势。而全细胞催化法不仅有微生物发酵法便于放大的优点，且不需要细胞破碎，减少了下游分离纯化的成本。但目前已知的s-腺苷甲硫氨酸合成酶(s-adenosylmethionine synthetase，mat)均存在酶活低、稳定性差的问题，使得底物的转化水平较低，产物得率远低于微生物发酵法，且常见的mat有严重的底物和产物抑制作用。全细胞催化法合成sam存在便于放大、生产周期较短、制备简单、省去酶纯化繁琐过程等优点，但是目前全细胞合成sam产量低，无法达到工业化水平。
技术实现思路
1、针对目前工业生产s-腺苷蛋氨酸存在合成酶催化效率低，稳定性差的问题，为了克服现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种s-腺苷蛋氨酸合成酶活性提高的突变体，并提高其全细胞催化法合成s-腺苷蛋氨酸的产量，对于促进s-腺苷蛋氨酸的合成具有普遍的意义。
2、本发明采用的技术方案如下：
3、克隆了酿酒酵母来源的sam2基因编码的s-腺苷蛋氨酸合成酶mat，采用swiss-model建立蛋白模型，分析其蛋白质结构，将蛋白质与底物进行分子对接，选择位点进行定点突变，对突变后带的酶进行活性测定，确定对酶活性有重要影响的位点，然后进行组合突变，迭加突变优势，获得相比野生型活性及稳定性提高的突变体。
4、本发明提供一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，进行以下任一种突变：
5、(1)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸(i189v)；
6、(2)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第371位天冬酰胺突变为精氨酸(i189v/n371r)；
7、(3)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第200位天冬氨酸突变为谷氨酸(i189v/d200e)；
8、(4)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺(i189v/q234n)；
9、(5)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，将第266位缬氨酸突变为组氨酸，并将第371位天冬酰胺突变为精氨酸(i189v/v266h/n371r)。
10、本发明还提供了编码所述突变体的基因。
11、本发明还提供了携带所述基因的表达载体。
12、本发明还提供了表达所述突变体，或携带所述表达载体的微生物细胞。
13、本发明还提供了生产s-腺苷蛋氨酸的方法，以所述突变体或所述微生物细胞为催化剂进行反应。
14、在本发明的一种实施方式中，将所述微生物细胞在培养体系中培养至od600为0.6～0.8，加入诱导剂25℃诱导24h，收集菌体；将菌体添加至含有底物的反应体系中反应2h。
15、在本发明的一种实施方式中，将重组单克隆接种到含有卡那的10ml lb液体培养基中，37℃220rpm培养10-12h，再将2％的培养液转接新的含卡那的50ml lb液体培养基中培养，培养约2-3h使od600＝0.6-0.8，加入过滤除菌的诱导剂iptg到终浓度为0.1mm，然后25℃220rpm培养12-24h，离心收集菌体。
16、在本发明的一种实施方式中，所述底物包括l-蛋氨酸、腺苷-5’-三磷酸二钠盐、氯化钾、氯化镁。所述反应体系中底物浓度分别为20～60mm，菌株od600＝(3.2)±0.2，在ph8±1、37℃下反应。。
17、本发明还提供了提高s-腺苷蛋氨酸合成酶催化活性的方法，在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上，进行以下任一种突变：
18、(1)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸；
19、(2)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第371位天冬酰胺突变为精氨酸；
20、(3)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第200位天冬氨酸突变为谷氨酸；
21、(4)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺；
22、(5)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，将第266位缬氨酸突变为组氨酸，并将第371位天冬酰胺突变为精氨酸。
23、本发明还提供了所述突变体或所述微生物细胞在制备s-腺苷蛋氨酸或含s-腺苷蛋氨酸的产品中的应用。
24、有益效果：
25、(1)对s-腺苷蛋氨酸合成酶mat的189位、200位、234位、266位、371位的一个或多个位点突变，得到了酶活提高的一系列突变体，将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸(i189v)，其比酶活较亲本提高了60.67％；将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第371位天冬酰胺突变为精氨酸(i189v/n371r)，其比酶活较亲本提高了342.82％；将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第200位天冬氨酸突变为谷氨酸(i189v/d200e)，其比酶活较亲本提高了159.00％；将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺(i189v/q234n)，其比酶活较亲本提高了147.45％；将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，将第266位缬氨酸突变为组氨酸，并将第371位天冬酰胺突变为精氨酸(i189v/v266h/n371r)，其比酶活较亲本提高了98.18％，相应组合突变的粗酶液酶活也较亲本显著提高。且189位、200位、234位、266位、371位的单点突变其比酶活较亲本都有不同程度的提高，说明该突变体的酶活得到大大提升。
26、(2)通过全细胞催化比较催化性能，在催化2h，亲本(wt)催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为276.32mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-i189v催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为479.91mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-i189v/n371r催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为1119.34mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-i189v/d200e催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为695.81mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-i189v/q234n催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为581.65mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-i189v/v266h/n371r催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为1552.81mg/l，较亲本提升明显。
1.一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其特征在于，在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上，进行以下任一种突变：
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.表达权利要求1所述突变体，或携带权利要求3所述表达载体的微生物细胞。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，以pet28a为表达载体，表达权利要求1所述突变体。
6.一种生产s-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述突变体，或权利要求4所述微生物细胞，或权利要求5所述重组大肠杆菌为催化剂，以l-蛋氨酸、腺苷-5’-三磷酸二钠盐、氯化钠、氯化镁为底物，进行反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在ph 7～9、37～60℃下反应至少2h。
8.提高s-腺苷蛋氨酸合成酶催化活性的方法，其特征在于，在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上，进行以下任一种突变：
9.权利要求1所述突变体，或权利要求4所述微生物细胞，或权利要求5所述重组大肠杆菌在制备s-腺苷蛋氨酸或含s-腺苷蛋氨酸的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品、药品或日化用品。
