本发明属于动物病毒检测，具体涉及一组用于禽类传染性支气管炎病毒全基因组测序的引物组及其应用。
背景技术：
1、禽传染性支气管炎(infectious bronchitis，ib)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，ibv)引发的严重危害全球养鸡业的重要病毒性传染病，该病主要侵害鸡呼吸道、肾脏、输卵管、胸肌、肠道等器官与组织，引起不同的临床致病型，如呼吸型、肾型、肌肉型、肠型等。我国在1972年首次报道鸡群中存在ib，并于1982年发现肾病变型。国内养鸡业发展迅速，品种多，数量大，养殖模式多样化，再加上活禽交易和疫苗免疫失败等诸多因素的影响，生产中ibv传播和流行的情况越来越复杂，造成养鸡场频繁发生ib疾病。
2、虽然临床上广泛使用疫苗免疫防控该病，但由于ibv基因组存在频繁的变异和重组，导致新基因型和血清型不断出现，从而造成我国鸡ib未能得到有效控制。长期流行病学监控及针对流行毒株的疫苗研发对于该病的防控具有重要的意义。弄清特定地区流行的ibv血清型或基因型是防控鸡ib的重要前提。血清学分型是通过感染鸡只血清与其他毒株交叉中和反应的亲缘关系进行分型的方法。由于该方法操作繁琐，且费用较高，因此在ibv分型研究中难以推广和应用。基因型是根据病毒基因组或单个基因序列信息进行系统发育学分析，通过构建进化树将病毒进行归类的一种方法。众多研究发现由于ibv的rna聚合酶缺乏校对功能以及基因组不连续转录机制非常容易造成ibv基因组发生突变和重组，从而导致病毒抗原性、组织嗜性和致病性发生改变。对ibv感染进行快速鉴别诊断，并获得其基因组信息，能为病毒早发现、早控制、溯源提供依据，尽可能减小其对养禽业带来的经济损失。纳米孔测序具有实时、便携、长读长、高通量等特点，可实现现场实时快速检测，及时准确鉴别病原体，给出精准检测结果；然而，目前尚无针对纳米孔测序优势设计的ibv的全基因组测序技术。因此，目前仍亟需一种基于三代纳米孔测序的鸡传染性支气管炎病毒全基因组测序技术，为ib的防控和疫苗的选择提供参考。
技术实现思路
1、本发明设计了ibv全基因组长pcr扩增特异性引物，并进一步提供一种纳米孔测序的ibv实时检测方法，充分发挥纳米孔测序在病原检测中实时、便携、长读长、高通量等优势。该检测方法可快速鉴别诊断ibv的感染，同时得到其全基因组序列，获得的全基因组序列可为病原变异重组及分子流行病学研究提供信息。
2、本发明第一方面的目的，在于提供一种禽类传染性支气管炎病毒的检测引物对。
3、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的禽类传染性支气管炎病毒的检测引物对的应用。
4、本发明第三方面的目的，在于提供一种禽类传染性支气管炎病毒的检测引物组。
5、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第三方面的禽类传染性支气管炎病毒的检测引物组的应用。
6、本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂。
7、本发明第六方面的目的，在于提供一种试剂盒。
8、本发明第七方面的目的，在于提供一种方法。
9、本发明第八方面的目的，在于提供一种禽类传染性支气管炎病毒测序片段的制备方法。
10、本发明第九方面的目的，在于提供一种检测系统。
11、为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是
12、本发明的第一个方面，提供一种禽类传染性支气管炎病毒的检测引物对，其特征在于：
13、所述检测引物对包括上游引物和下游引物。
14、所述上游引物的核苷酸序列包括seq id no.1～20、seq id no.41～60中的任一种。
15、所述下游引物的核苷酸序列包括seq id no.21～40、seq id no.61～80中的任一种。
16、所述核苷酸序列如seq id no.1～20所示的上游引物分别与所述核苷酸如seq idno.21～40所示的下游引物配对。
17、所述核苷酸序列如seq id no.21～40所示的上游引物分别与所述核苷酸如seqid no.41～60所示的下游引物配对。
18、在本发明的第一个方面中，本领域技术人员也可以通过一到两个碱基的替换，得到能够实现本发明扩增效果的新引物。
19、本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的检测引物对在制备检测禽类传染性支气管炎病毒的产品中的应用。
20、本发明的第三个方面，提供一种禽类传染性支气管炎病毒的检测引物组，所述检测引物组的核苷酸序列如seq id no.1～80所示。
21、本发明的第四个方面，提供本发明第三个方面所述的检测引物组在制备检测禽类传染性支气管炎病毒的产品中的应用。
22、优选地，所述产品用于a1)～a3)中的任一种：
23、a1)检测禽类传染性支气管炎病毒；
24、a2)鉴定禽类传染性支气管炎病毒；
25、a3)全基因组测序分析禽类传染性支气管炎病毒。
26、本发明的第五个方面，提供一种试剂，包括本发明第一个方面所述的检测引物对、或本发明第三个方面所述的检测引物组。
27、本发明的第六个方面，提供一种试剂盒，包括本发明第五个方面所述的试剂。
28、优选地，所述检测试剂盒包括第一引物组和第二引物组，其中，第一引物组包括20对扩增引物，具体序列如seq id no.1-40所示；第二引物组包括20对扩增引物，具体序列如seq id no.41-80所示。
29、优选地，所述试剂盒还包括dntps、dna聚合酶、阳性标准模板、阴性对照质控标准品、反应缓冲液、和水中的至少一种。
30、优选地，所述dna聚合酶包括taq dna聚合酶、bsu dna聚合酶、bst dna聚合酶、koddna聚合酶、phusion dna聚合酶、和t7 dna聚合酶中的至少一种。
31、优选地，所述反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4、和tween20中的至少一种。
32、优选地，所述阳性标准模板用于判断检测体系是否能够成功完成检测。
33、优选地，所述阴性标准模板用于判断检测体系不存在样本污染。
34、本发明的第七个方面，提供b1)～b3)中的任一种方法，使用本发明第六个方面所述的试剂盒对样品进行测序；
35、b1)一种非诊断目的地检测禽类传染性支气管炎病毒的方法；
36、b2)一种禽类传染性支气管炎病毒溯源的方法；
37、b3)一种鉴定禽类传染性支气管炎病毒的方法；
38、优选地，所述样品包括临床样本或环境样本。
39、优选地，临床样本包括咽拭子、气管、支气管、肾脏中的至少一种。
40、优选地，所述溯源是指，对病毒进行全基因组测序分析，并基于全基因组序列与现有数据库进行对比，判断病毒的来源。
41、优选地，所述鉴定是指，对病毒进行全基因组测序分析，并基于全基因组序列与现有数据库进行对比，鉴定病毒的具体种类，或者判断病毒是否出现新的变异类型。
42、在本发明的一些实施例中，所述方法的全流程为：
43、收集样本，提取rna，利用本发明第三个方面所述的检测引物组、本发明第六个方面所述的试剂盒对待检测样本逆转录得到的cdna进行扩增，纯化，得到测序片段，测序，分析结果。
44、优选地，所述样本包括临床样本或环境样本。
45、优选地，所述临床样本包括咽拭子、气管、支气管和肾脏中的至少一种。
46、优选地，所述测序为三代测序。
47、优选地，所述引物组包括第一引物组和第二引物组，其中，第一引物组包括20对扩增引物，具体序列如seq id no.1-40所示；第二引物组包括20对扩增引物，具体序列如seqid no.41-80所示。
48、优选地，利用第一引物组和第二引物组分别对待检测样本逆转录得到的cdna进行扩增，扩增产物经纯化得到测序片段。
49、上述引物组分组的目的是为了避免引物组之间会有交叉反应，基于该原因，本发明的引物组也可以依次序分成更多的组别，例如第一、第二、第三、第四引物组，分别包括10对测序引物，具体序列如seq id no.1-20、seq id no.20-40、seq id no.40-60、seq idno.70-80所示。
50、本发明的第八个方面，提供一种禽类传染性支气管炎病毒测序片段的制备方法，其特征在于：
51、利用本发明第三个方面所述的检测引物组、本发明第六个方面所述的试剂盒对待检测样本逆转录得到的cdna进行扩增，纯化，得到测序片段。
52、本发明的第九个目的，提供一种禽类传染性支气管炎病毒的检测系统，所述检测系统包括以下构件：
53、1)禽类传染性支气管炎病毒的检测构件；
54、2)数据处理构件；
55、3)结果输出构件；
56、所述禽类传染性支气管炎病毒的检测构件包括本发明第一个方面所述的检测引物对、本发明第三个方面所述的检测引物组、本发明第六个方面所述的试剂盒中的至少一种；
57、优选地，所述检测构件包含检测仪器，所述检测仪器选自荧光定量pcr仪、测序仪中的一种或多种。
58、优选地，所述测序仪为三代测序仪。
59、优选地，所述数据处理构件被配置为：
60、根据检测构件检测的待测样品中禽类传染性支气管炎病毒的检出与否的结果，判断待测样品中是否含有禽类传染性支气管炎病毒。
61、优选地，所述数据处理构件的判断标准为：
62、若待测样品中检出禽类传染性支气管炎病毒，则待测样品中含有或疑似含有禽类传染性支气管炎病毒。
63、若待测样品中未检出禽类传染性支气管炎病毒，则待测样品中不含有或疑似不含禽类传染性支气管炎病毒。
64、在本发明的上述方面：
65、优选地，所述禽类传染性支气管炎病毒的感染宿主包括禽类；所述禽类包括鸡、鸭、鹅、鸽、雁、鹌鹑、火鸡中的至少一种。
66、优选地，所述禽类传染性支气管炎病毒为鸡传染性支气管炎病毒。
67、在本发明的一些实施方式中，所述鸡传染性支气管炎病毒包括m41株、h120株、ldt3-a株、h52株、4/91株中的至少一种。
68、优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、检测芯片、核酸文库中的至少一种。
69、本发明的有益效果是：
70、本发明提供了一种禽类传染性支气管炎病毒全基因组的扩增引物和方法。禽类传染性支气管炎病毒的检测引物组包括40对扩增引物，根据美国生物技术信息中心基因序列数据库genbank中已公开的ibv的全基因组序列，按照基因组位置设计得到40对扩增引物，具体序列如seq id no.1～80所示。本发明提供的检测引物组可以实现对禽类传染性支气管炎病毒的较均匀覆盖，在纳米孔测序中，实现了基因组100％区域覆盖。本发明提供的禽类传染性支气管炎病毒全基因组的测序片段制备方法简便易操作，扩增效果好，且纳米孔测序具有边测序边实时分析的优势，可以大大缩短检测时间，能快速鉴别诊断禽类传染性支气管炎病毒的感染，同时得到其全基因组序列，获得的基因组序列能为病毒溯源、病原变异追踪、新型毒株识别和预警等提供科学依据。
1.一种禽类传染性支气管炎病毒的检测引物对，其特征在于：
2.权利要求1所述的检测引物对在制备检测禽类传染性支气管炎病毒的产品中的应用。
3.一种禽类传染性支气管炎病毒的检测引物组，其特征在于：
4.权利要求3所述的检测引物组在制备产品中的应用，所述产品用于a1)～a3)中的任一种：
5.一种试剂，包括权利要求1所述的检测引物对、或权利要求3所述的检测引物组。
6.一种试剂盒，包括权利要求3所述的检测引物组；
7.b1)～b3)中的任一种方法，使用权利要求3所述的检测引物组、或权利要求6所述的试剂盒对样品进行测序；
8.一种禽类传染性支气管炎病毒测序片段的制备方法，其特征在于：
9.一种测序方法，包括以下步骤：
10.一种禽类传染性支气管炎病毒的检测系统，所述检测系统包括以下构件：
