本发明涉及微生物学和生物，特别是与微生物培养基的设计和应用相关。具体而言，本发明涉及一种用于固氮细菌的选择性筛选和快速增殖的两种培养基配方及其应用方法。这些培养基在农业、环境修复、生物肥料开发等领域具有重要应用价值。
背景技术：
1、固氮细菌是能够将大气中的氮气(n2)转化为植物可利用的氨(nh3)的微生物，它们在生态系统中起着至关重要的作用，尤其是在农业中作为生物肥料有着广泛的应用。目前，固氮细菌的筛选通常依赖于无氮培养基，通过去除氮源的方式，强制固氮细菌从空气中获取氮素。然而，现有的无氮培养基往往存在选择性差、培养时间长等缺点，导致固氮菌筛选效率低下。此外，固氮细菌的实验室培养常面临生长缓慢、产量低的难题，使得在短时间内获得足够的菌体量变得困难。
2、现有技术中常用的无氮培养基配方(如ashby培养基)虽然能部分解决固氮菌的筛选问题，但在特异性和选择性上仍存在局限，容易受到杂菌污染或非固氮细菌的干扰。而高效增殖培养基方面，虽然已有多种商用培养基(如lb培养基)可用于一般细菌的生长，但它们并非专门为固氮菌设计，且在大规模培养时可能面临成本较高、增殖效率不稳定等问题。
3、因此，开发一种同时具备高效选择性和快速增殖能力的新型培养基，对于提高固氮细菌的筛选和培养效率具有重要意义。
技术实现思路
1、基于此，本发明的目的在于提供了一种用于选择性富集固氮细菌的无氮培养基配方，其碳源为葡萄糖，辅以磷酸盐缓冲液、镁源、铁源、刚果红及微量元素，该培养基能够通过选择性排除不具备固氮能力的微生物，富集固氮细菌；以及在短时间内实现固氮细菌大量增殖的高效增殖培养基配方，其含有高浓度的葡萄糖、酵母膏、蛋白胨及其他促进细菌生长的成分，适用于细菌的快速增殖，并能在短时间内获得大量生物量。
2、本发明的另一个目的还在于提供了一种用于固氮细菌筛选和增殖的培养基配方的应用方法，将高效增殖培养基与无氮培养基这两种培养基联用，能够显著提升固氮细菌的筛选效率和培养产量。
3、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
4、一种用于固氮细菌筛选和增殖的培养基配方，包括无氮培养基和高效增殖培养基，其中：
5、所述无氮培养基，包含以下成分：
6、葡萄糖或蔗糖：10g/l，
7、磷酸二氢钾：0.5g/l，
8、磷酸氢二钾：0.5g/l，
9、硫酸镁：0.2g/l，
10、硫酸亚铁：0.05g/l，
11、氯化钙：0.1g/l，
12、微量元素：mnso4、h3bo3、na2moo4各0.01g/l，
13、刚果红：0.2g/l，
14、琼脂：15g/l，
15、水：至1000ml；
16、ph：调至7.0(使用1m hcl或1m naoh进行调节)；
17、所述高效增殖培养基，包含以下成分：
18、葡萄糖：20g/l，
19、酵母膏：5g/l，
20、蛋白胨：5g/l，
21、磷酸二氢钾：1g/l，
22、磷酸氢二钾：1g/l，
23、硫酸镁：0.5g/l，
24、氯化钠：5g/l，
25、氯化钙：0.1g/l，
26、微量元素：mnso4、znso4各0.01g/l，
27、水：至1000ml，
28、ph：调至7.0(使用1m hcl或1m naoh进行调节)。
29、可选地，所述无氮培养基的制备方法，包括以下步骤：
30、将除琼脂和刚果红外的所有成分溶解在适量水中；
31、加入琼脂，加水至1000ml，并加热至沸腾，使其完全溶解；
32、在培养基溶液冷却至约50℃时，加入刚果红，搅拌均匀以确保染料完全溶解；
33、调整ph至7.0，在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟；
34、灭菌后将培养基倒入无菌培养皿中，待其冷却凝固形成固体培养基。
35、进一步地，所述无氮培养基恒温培养条件为：25℃恒温培养2～5d。
36、可选地，所述高效增殖培养基的制备方法，包括以下步骤：
37、将所有成分溶解于1000ml的水中，搅拌均匀后，调整ph至7.0，在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟，灭菌后将培养基冷却至常温后，用接种环挑取单菌落接种至培养基中。
38、进一步地，所述高效增殖培养基培养条件为：25℃，180r/min恒温振荡培养48h。
39、进一步地，所有培养基均经过高压灭菌锅在121℃的条件下灭菌20min后使用。
40、相应地，本发明还要求保护一种前述的培养基配方的应用方法，包括以下步骤：
41、(1)采集样品：选择可能含有固氮细菌的环境样品，如根瘤、土壤或水体；
42、(2)配置培养基：无氮培养基、高效增殖培养基；
43、(3)菌株的分离与纯化：在超净台内，将样品用无菌镊子夹碎，接种在无氮培养基上，恒温培养，并观察菌落特征；
44、(4)菌株增殖：挑选单菌落接种于细菌高效增殖培养基培养，期间每隔24h测定菌液od600值及相对应的ph值，重复三次；
45、(5)菌株固氮能力检测：将菌液经过离心收集菌体，无菌水清洗2～3次，用测酶活限氮培养基悬浮洗涤后的菌体，并调节od值(λ＝600nm)约为0.6，取10ml菌液加入100ml无菌培养瓶中，使用丁基橡胶塞密封瓶口，用抽真空装置抽取瓶中10％体积空气(10ml)，并用高纯度(99.999％)乙炔(c2h2)置换，使乙炔(c2h2)占培养瓶中气体总体积的10％，在25℃，180r/min恒温振荡培养4-6h。培养结束后，使用带有火焰离子化检测器(fid)的气相色谱仪测定血清瓶中的乙烯气体浓度。
46、通过乙炔还原法测定的固氮酶活性计算方法如下：
47、
48、式(1)中，ara为固氮酶活性(nmol c2h4 ml-1 h-1)；为乙烯浓度(ppm)；vheadspace为瓶内顶空体积(ml)；vtotal为瓶内总体积(ml)；vsolid为瓶内菌液样品体积(ml)；22.4为1mol气体在标准大气压下的体积(l·mol-1)；t为培养时间(h)；wsample为样品体积(ml)。
49、完成乙烯含量测定后，计算得到固氮菌的固氮酶活性，单位为c2h4nmol ml-1h-1(nmol为c2h4单位，ml为菌液体积，h培养时间单位)；
50、(6)菌株保存：将菌液按照3％的接种量接种于高效增殖培养基，在25℃，180r/min恒温振荡培养48h，期间每隔12h测定菌液od600值及相对应的ph值，重复三次；
51、将所得菌液用移液枪转移至装有浓度为20％灭菌甘油的冷冻保存管中，摇晃均匀后放置于实验室超低温冰箱-80℃冷冻保存。
52、可选地，所述步骤(1)中，采集样品包括：野葛、大豆、鸡眼草、白三叶草等植物根瘤，以及玉米、牧草根和根际土。
53、可选地，所述测酶活限氮培养基组分(1l体系)包括：26mg二水合氯化钙(cacl2·2h2o)、30mg七水合硫酸镁(mgso4·7h2o)、0.33mg一水合硫酸锰(mnso4·h2o)、7.6mg二水合钼酸钠(na2moo4·2h2o)、3.4g磷酸二氢钾(kh2po4)、26.3g十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)、36mg柠檬酸铁(c6h5o7fe·xh2o)、4g葡萄糖(glucose)、0.3g谷氨酸(l-glutamicacid)、10μg维生素b7(biotin)、10μg对氨基苯甲酸(c7h7no2)。
54、与现有技术相比的优势与创新
55、1.无氮培养基的优势与创新
56、高选择性：本发明设计的无氮培养基通过完全去除氮源，强制细菌依赖固氮能力获取氮素。这一创新提高了固氮细菌筛选的特异性，显著减少了非固氮菌的干扰。相比现有的无氮培养基，本发明更能有效富集固氮微生物，减少培养过程中的杂菌污染。
57、优化的碳源与缓冲系统：在本发明的无氮培养基中，碳源选择了易于代谢的葡萄糖，并配以优化的磷酸盐缓冲液。这一配方能够维持稳定的ph环境，确保固氮细菌的最佳生长条件，同时减少了由于ph波动引起的抑制效应。
58、强化微量元素配比：通过添加特定的微量元素(如硫酸锰、硼酸、钼酸钠)，培养基更好地支持了固氮酶的活性和固氮过程。这一设计进一步提升了固氮细菌的富集效率，优于传统无氮培养基。
59、多功能性：无氮培养基可通过添加琼脂转换为固体培养基，用于单菌落分离。这种灵活性使其适用于不同的实验需求，提高了培养基的应用广度。
60、视觉识别：刚果红的添加使培养基的颜色更加鲜艳，有助于更清晰地观察和记录细菌的生长特征和胶囊多糖的存在。
61、功能扩展：此配方不仅可以筛选固氮细菌，还可以用于观察细菌的其他生物学特性，增加了培养基的多功能性。
62、提高选择性：通过颜色对比，可以更容易区分不同细菌的生长特征，从而提高了筛选和鉴定的效率。
63、这种改进后的无氮固体培养基结合了传统的固氮细菌筛选功能和颜色检测功能，有助于更好地理解细菌的生物学特性和提高实验的准确性。
64、2.高效增殖培养基的优势与创新
65、加速细菌生长：本发明的高效增殖培养基通过提供高浓度的碳源(葡萄糖)和氮源(酵母膏、蛋白胨)，显著提高了细菌的生长速率。与现有的常规培养基相比，该配方能够在更短时间内产生更多的生物量，特别适合需要快速获得大量细菌的实验或工业应用。
66、增强的营养成分：酵母膏和蛋白胨提供了丰富的维生素、氨基酸和生长因子，支持细菌的全面生长。这些成分不仅促进了细菌的快速繁殖，还提高了细菌的代谢活性，使其更具活力和适应性。
67、广泛适用性：虽然该培养基专为快速增殖设计，但其成分配比适用于多种细菌，具有广泛的应用范围。它可以用于常见实验室细菌的培养，也可用于特殊菌株的工业生产。
68、3.组合创新
69、整体解决方案：本发明不仅单独优化了无氮培养基和增殖培养基，还提供了一个从固氮菌筛选到大量增殖的完整解决方案。这种组合式的创新能够显著提升微生物研究和应用的效率，为用户提供一站式的技术支持，优于传统的单一培养基设计。
1.一种用于固氮细菌筛选和增殖的培养基配方，其特征在于，包括无氮培养基和高效增殖培养基，其中：
2.根据权利要求1所述的固氮细菌筛选和增殖的培养基配方，其特征在于，所述无氮培养基的制备方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的固氮细菌筛选和增殖的培养基配方，其特征在于，所述无氮培养基恒温培养条件为：25℃恒温培养2～5d。
4.根据权利要求1所述的固氮细菌筛选和增殖的培养基配方，其特征在于，所述高效增殖培养基的制备方法，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的固氮细菌筛选和增殖的培养基配方，其特征在于，所述高效增殖培养基培养条件为：25℃，180r/min恒温振荡培养48h。
6.一种根据权利要求1-5任一所述的用于固氮细菌筛选和增殖的培养基的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采集样品包括：野葛、大豆、鸡眼草、白三叶草根瘤，以及玉米、牧草根和根际土。
8.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述步骤(3)中，菌落呈现表面光滑、湿润，边缘整齐，颜色为半透或白色。
9.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述步骤(5)中，乙炔还原法测定固氮酶活性包括：
10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，1l所述测酶活限氮培养基组分包括：26mg二水合氯化钙、30mg七水合硫酸镁、0.33mg一水合硫酸锰、7.6mg二水合钼酸钠、3.4g磷酸二氢钾、26.3g十二水合磷酸氢二钠、36mg柠檬酸铁、4g葡萄糖、0.3g谷氨酸、10μg维生素b7、10μg对氨基苯甲酸。
