本发明属于微生物代谢工程，具体涉及一种用于合成lnfpⅰ的α-1,2-岩藻糖基转移酶、重组工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、母乳是供婴儿关键生长发育阶段所需的必要营养物质，如可提供能量、免疫调节、改善肠道菌群分布及促进大脑发育的作用。母乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是一种存在于母乳中的可充当益生元的营养物质。hmos作为继乳糖和脂质后的第三大固体成分，在初乳中含量可达20g/l以上，并且其在促进新生儿的健康和生长发育方面具有独特的生理功能。乳糖-n-岩藻黄素五糖i(lnfpⅰ)是人类母乳中仅次于2′-fl的丰度第二高的岩藻糖基化hmo。lnfpⅰ属于岩藻糖基化的中性母乳寡糖，在母乳中的含量约为0.8-5g/l，分子式是c32h55no25，分子质量为853.77。
2、lnfpⅰ被发现具有多种功能活性，如调节肠道菌群、抵抗病原体粘附、免疫调节、促进神经系统发育和修复、降低血清胆固醇水平、减少肥胖、抑制肠道细菌生长和抑制体内炎症反应，并且表现出高安全性。
3、目前，lnfpⅰ可以通过母乳提取、化学合成、一锅多酶法获得。然而，这三种方法都存在明显的局限性，无法大批量获取与合成，这极大限制lnfp i的市场化应用。相比之下，微生物发酵法已经被广泛应用于从头合成hmos；通过定向改造工程菌株的内源代谢，使其能利用廉价易获取的原料实现lnfp i的高效绿色合成，兼具安全、环保、可持续的发展的特点。
4、在实施lnfp i的从头合成细胞工厂构建过程中，α-1,2-岩藻糖基转移酶是关键限速酶，其催化活性决定了lnfp i合成的最终滴度。然而目前已报道的可用于生物合成lnfpi的α-1,2-岩藻糖基转移酶数量较少，催化活力有限。因此，亟需筛选新型的α-1,2-岩藻糖基转移酶以增加lnfp i合成过程中的可用酶及高效酶。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于合成lnfpⅰ的α-1,2-岩藻糖基转移酶、重组工程菌株及其构建方法和应用，解决目前合成lnfp i可用生物合成的α-1,2-岩藻糖基转移酶数量较少、生产滴度不高的问题。
2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
3、本发明从微生物中筛选出了一种来源于alphaproteobacteria的α-1,2-岩藻糖基转移酶(ncbi号为wp_037157133.1)，命名为ry2ft。所述α-1,2-岩藻糖基转移酶ry2ft用于合成lnfpⅰ，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶ry2ft的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、基于上述，本发明提供一种含有上述α-1,2-岩藻糖基转移酶的重组工程菌。
5、本发明还提供一种重组工程菌的构建方法，将重组质粒pcdf-wbgo、prsf-cbgw、pet-ry转入菌株e06，得到所需重组工程菌e06-1；
6、所述pet-ry含有如权利要求1所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因，用于过表达所述α-1,2-岩藻糖基转移酶。其中，pet-ry为petduet-1衍生质粒，整合并过表达新型α-1,2-岩藻糖基转移酶ry2ft的编码基因。
7、进一步的，所述重组质粒pcdf-wbgo通过将wbgo基因克隆到pcdfduet-1中获得；
8、所述prsf-cbgw的构建方法为：
9、使用引物pcdf-galu-f和pcdf-galu-r扩增pcdf-wbgo质粒的载体片段，然后通过吉布森组装法进行片段组装，生成重组质粒pcdf-galu-wbgo；其中，pcdf-galu-wbgo为pcdfduet-wbgo的衍生质粒，整合并过表达galu和wbgo。
10、以重组质粒pcdf-galu-wbgo中galu位置为一号克隆位置，wbgo位置为二号克隆位置；通过将manc-manb基因簇构建于质粒的一号克隆位置，gmd-wcag基因簇构建于二号克隆位置，获得prsf-cbgw；其中，prsf-cbgw为prsfduet-1衍生质粒，整合并过表达manc-manb，gmd-wcag。
11、进一步的，所述galu编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；wbgo编码的氨基酸序列如seq id no.3所示；manc-manb编码的氨基酸序列如seq id no.4所示；gmd-wcag编码的氨基酸序列如seq id no.5所示。
12、进一步的，所述菌株e06以大肠杆菌为出发菌株，敲除出发菌株基因组中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj，β-半乳糖苷酶编码基因lacz，udp-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶编码基因wecb，糖外排蛋白编码基因seta，葡萄糖脱氢酶编码基因gcd；并将菌株基因组中nagb、poxb、arsb位点分别替换成编码β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶的基因lgta；同时，将udp-葡萄糖-6-脱氢酶编码基因ugd位点替换为大肠杆菌mg1655基因组来源的编码尿苷二磷酸葡萄-4-差向异构酶的基因gale，并在基因组上过表达磷酸氨基葡萄糖变位酶编码基因glmm，获得重组菌株e06。
13、进一步的，所述所述出发菌株为大肠杆菌bl21(de3)；
14、所述β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述尿苷二磷酸葡萄-4-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述磷酸氨基葡萄糖变位酶的氨基酸序列如seq id no.8所示。
15、上述重组工程菌及构建方法得到的重组工程菌可在制备lnfpⅰ中进行应用。
16、基于上述，本发明还提供一种生产乳糖-n-岩藻黄素五糖i的方法，以上述构建方法得到的重组工程菌为发酵菌株，加入乳糖和iptg，发酵生产乳糖-n-岩藻黄素五糖i。
17、在一种实施方式中，生产乳糖-n-岩藻黄素五糖i的方法，包括以下步骤：
18、(1)将重组菌接种于种子培养基，培养，获得种子液；
19、(2)将步骤(1)中所获得的种子液接种于发酵培养基，培养至od600为0.6-0.8，向培养体系中加入终浓度为5g/l的乳糖和0.1mm的iptg，于25℃发酵生产lnfp i。
20、进一步的，所述发酵培养基含有甘油，其浓度为30g/l；
21、在一种实施方式中，生产乳糖-n-岩藻黄素五糖i的方法，包括以下步骤：
22、(1)将所述重组菌接种于种子培养基，培养，获得一级种子液；
23、(2)将步骤(1)中所获得的种子液接种于二级种子培养基，培养至od600为2-3，随即将二级种子液接种于5l的发酵罐中，按10％的比例接种，培养至od600为16-20，随后向发酵罐培养体系中加入终浓度为5g/l的乳糖和0.1mm的iptg，于25℃发酵生产lnfp i。
24、进一步的，发酵期间的溶氧为20～50％；优选的，溶氧为30％。
25、进一步的，发酵期间的ph为6～7；可优选的，ph为6.5～6.7。
26、进一步的，发酵期间，通过向发酵体系中流加氨水维持发酵体系ph。
27、进一步的，所述发酵培养基中含有甘油，通过补料维持发酵体系中甘油充足，且通过补料维持发酵体系中含有乳糖。
28、在一种实施方式中，生产乳糖-n-岩藻黄素五糖i的方法，包括以下步骤：
29、(1)将所述重组菌接种于种子培养基，培养，获得一级种子液；
30、(2)将步骤(1)中所获得的种子液接种于二级种子液，培养至od600为2-3，向培养体系中加入终浓度为5g/l乳糖和0.1mmiptg，于25℃发酵生产lnfp i。
31、进一步的，发酵期间的溶氧为20～60％；优选的，溶氧为30％。
32、进一步的，发酵期间的ph为6～7；优选的，ph为6.5～6.7。
33、进一步的，发酵期间通过向发酵体系中流加氨水维持发酵体系ph。
34、进一步的，所述发酵培养基中含有甘油，通过补料维持发酵体系中甘油充足，且通过补料维持发酵体系中含有乳糖。
35、进一步的，发酵期间搅拌速度维持在350rpm。
36、发明的有益效果在于：
37、(1)本发明构建得到的重组菌株e06-1能够实际有效地生产lnfp i，并且在摇瓶发酵、5l发酵罐、百升发酵罐中均能可持续地合成lnfp i。
38、(2)本发明的重组菌株中引入了新筛选出的α-1,2-岩藻糖基转移酶ry2ft，丰富了目前能实现乳糖-n-岩藻黄素五糖i生物合成的酶的数量。
1.一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶用于合成lnfpⅰ，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种含有如权利要求1所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的重组工程菌。
3.一种重组工程菌的构建方法，其特征在于，将重组质粒pcdf-wbgo、prsf-cbgw、pet-ry转入菌株e06，得到所需重组工程菌e06-1；
4.根据权利要求3所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pcdf-wbgo通过将wbgo基因克隆到pcdfduet-1中获得。
5.根据权利要求4所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，所述prsf-cbgw的构建方法为：
6.根据权利要求5所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，所述galu编码的氨基酸序列如seq id no.2所示；wbgo编码的氨基酸序列如seq id no.3所示；manc-manb编码的氨基酸序列如seq id no.4所示；gmd-wcag编码的氨基酸序列如seq id no.5所示。
7.根据权利要求3所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，所述菌株e06以大肠杆菌为出发菌株，敲除出发菌株基因组中的udp-葡萄糖脂质载体转移酶编码基因wcaj，β-半乳糖苷酶编码基因lacz，udp-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶编码基因wecb，糖外排蛋白编码基因seta，葡萄糖脱氢酶编码基因gcd；并将菌株基因组中nagb、poxb、arsb位点分别替换成编码β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶的基因lgta；同时，将udp-葡萄糖-6-脱氢酶编码基因ugd位点替换为大肠杆菌mg1655基因组来源的编码尿苷二磷酸葡萄-4-差向异构酶的基因gale，并在基因组上过表达磷酸氨基葡萄糖变位酶编码基因glmm，获得重组菌株e06。
8.根据权利要求3所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，所述所述出发菌株为大肠杆菌bl21(de3)；
9.一种如权利要求2所述的重组工程菌或如权利要求3-8任意一项所述构建方法得到的重组工程菌在制备lnfpⅰ中的应用。
10.一种生产乳糖-n-岩藻黄素五糖i的方法，其特征在于，以权利要求3-8任意一项所述构建方法得到的重组工程菌为发酵菌株，加入乳糖和iptg，发酵生产乳糖-n-岩藻黄素五糖i。
