本发明涉及尿苷二磷酸生产，具体涉及一种尿苷二磷酸的制备方法。
背景技术：
1、尿苷二磷酸(uridine diphosphate，udp)是一种核苷酸，是由焦磷酸(pyrophosphate)官能基加上五碳核糖及碱基尿嘧啶组成。
2、尿苷二磷酸(udp)是合成阿普林津(ampligen)的原料之一。阿普林津是一种错配双链rna药物(polyl:c12u)，具有抗病毒和免疫调节的双重作用，高效低毒。目前，在国外该药正在进行一些疾病的临床实验，包括慢性疲劳综合症、艾滋病、乙肝等。
3、目前对于尿苷二磷酸(udp)的制备方法很少有人进行深入的研究，只是其衍生物，尤其是udp糖类由于药用广泛而引起国内外的重视。尿苷二磷酸葡萄糖(uridinediphosphate glucose，udpg)，是广泛分布于微生物、动植物细胞内的一种核苷酸糖，在生物体内，当合成各种苷、寡糖、多糖时用作葡萄糖的供体。尿苷二磷酸(udp)也是酶催化合成尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)的重要底物之一。
4、中国专利cn1962875b公开了一种尿苷二磷酸(udp)的制备方法，其包括如下步骤：将尿苷一磷酸(ump)与啤酒酵母混合发酵，发酵终止后得尿苷三磷酸(utp)发酵液；然后将所述的尿苷三磷酸(utp)发酵液进行预处理，并分离纯化；再将纯化后的尿苷三磷酸(utp)进行酸热降解；最后将酸热降解后的产物进行过滤、分离和精制处理，获得的尿苷二磷酸产品。该专利方法酸热降解时，ph值为0.8～1.2，温度为90～100℃，生产条件不利于工业化生产。
5、中国专利cn108486195a公开了一种用酶法制备udp的方法，在一个体外(细胞外)反应系统中，以尿苷(uridine)、糖类碳源为底物，加入无机离子与酵母，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸酶作为催化剂，通过生物转化产生尿苷二磷酸发酵液。但是该方法底物浓度为4％左右，且尿苷二磷酸酶的用量较高。
6、中国专利cn115896212a公开了一种尿苷二磷酸的制备方法，其包括如下步骤：在尿苷激酶、atp或其二钠盐存在的条件下，将尿苷通过尿苷激酶磷酸化得到尿苷酸；在尿苷酸激酶、atp或其二钠盐存在的条件下，将尿苷酸通过尿苷酸激酶磷酸化得到尿苷二磷酸，该专利方法中用到尿苷激酶的用量较高，并且在该反应中，乙酰磷酸(ac-pi)在乙酸激酶的作用下脱磷酸，脱下的磷酸基团用于atp的再循环，并伴有乙酸的产生，会影响环境，且转化时间比较长。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种尿苷二磷酸的制备方法，尿苷二磷酸的纯度高，生产成本低，适于工业化生产。
2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
3、一种尿苷二磷酸的制备方法，包括以下步骤：
4、a：通过在固体lb培养基中加入1％w/v的尿苷和0.5％w/v的尿苷一磷酸，筛选出能够提高尿苷二磷酸转化率的高质量菌体，得培养菌液；
5、b：将培养菌液以5～10％v/v的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基初始ph值为7.0，初始空气流量为0.5m3/l，维持压力为0.05mpa，发酵温度35～38℃，转速为250～300rpm进行发酵，发酵过程中搅拌转速根据溶氧量自动偶联设定，温度由发酵罐自动控制，ph通过加入体积分数为50％氨水维持，发酵24h前保持do值为20～30％，培养至菌液od600值为30～60，加终浓度0.2％wt的阿拉伯糖诱导，并加入0.1mm的钴铵素，30℃恒温发酵24h，得到发酵液；
6、c：取发酵液中的菌体进行细胞破碎，得到细胞破碎液，并与尿苷一磷酸、atp、mg2+、poly-p混合，在30-40℃下转化2-4h，得转化液；
7、d：使用陶瓷膜对转化液进行过滤，收集陶瓷膜清液进入超滤膜过滤，得超滤膜清液；
8、e：然后在超滤清液中加入萃取剂进行萃取2-3次，静置分层后，取下层液，搅拌速度为100-300rpm，搅拌0.5-1h，静置30-40min，收集下层料液；
9、f：下层料液调ph至7-8后进强碱性阴离子交换树脂，然后加入磷酸钠缓冲液，最后进氯化钠溶液进行洗脱，洗脱至流出液在快速纸电泳检出无udp斑点，收集洗脱液；
10、g：洗脱液进行纳滤膜浓缩，得到的浓缩液中加入70-90％v/v的乙醇，调整体系中的乙醇浓度为30-50％，用盐酸调至ph值为2-4，然后降温至10-15℃，醇沉1-2h后抽滤、洗涤，得到高纯度的尿苷二磷酸。
11、优选的，步骤a中具体的筛选条件为：将含有聚磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的重组大肠杆菌在固体培养基上涂布后，放于37℃环境内培养16h，挑取1～2cm2的菌苔接种于1llb液体培养基，37℃、220rpm转速下恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8，得培养菌液；
12、含有聚磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的重组大肠杆菌具体氨基酸序列如seq idno.1所示：
13、atggcggacc cggctgttgt tccagtggca ccagttgcgg ctccggcagc gacagacggtcctccggaac tgccaccggc agctacgcca gcagttgcgc acggtccgcg tcagtttccg cgtgcggatcaggatgcaat ccgtgaagca ttcgaaagcg gtcgctaccc atattcccgt ttaatgggcc gtggtccgtacgagaaagaa aaagctctgc tccaagccga acttctgaaa gtccagattt gggcgcagga aactggccagaagttcgtag tactgatgga gggtcgtgac gctgcaggca aaggtggcac cattaaacgt tttatggaacacctgaaccc gcgttacgca cgtgtcgtgg ctctgacgaa accgtctgac aaagagaagg gtgaatggtttttccagcgt tatatccagc atttgccgac cgcaggtgaa atcgttttct atgatcgttc ctggtacaaccgtgcaggcg ttgaacgtgt aatgggcttc tgctctcctt ctgaatatct ggagttcatg cgccaggtgccagaactcga acgcatgctc gttcgctccg gtatccgcct ctacaaatac tggttctctg tcacccgtgaggagcagcac cgccgtttca ccgcgcgtga aaccgacccg ctcaagatgt ggaaactgtc gccaatcgacaaagcatctc tggacaaatg ggacgattac accgaggcca aagaagcaat gttcttctac accgacaccgccgatgcgcc gtggaccatc gtcaaaagca acgacaaaaa acgcgcacgc ttgaactgca tgcgccacttcctgagcacc attgactacc caggtaaaga tgcttctgtc atcggtactc cagacccact gatcgtcggtcgtgcgagtc aagttattgg tggtgcgggt cacatcctgg ataccgccct gccgccagac tttcgtaaagcgttcgacgc gggtaaaact ccggctactg cgcgtgcgca ggaggcagct caggcataaa aggagatataatggcaaacg ctgaacgtat gataacgcgc gtccacagcc aacgtgagcg tttgaacgaa acgcttgtttctgagagaaa cgaagtcctt gccttgcttt ccagggttga agccaaaggt aaaggtattt tacaacaaaaccagatcatt gctgaattcg aagctttgcc tgaacaaacc cggaagaaac ttgaaggtgg tcctttctttgaccttctca aatccactca ggaagcaatt gtgttgccac catgggttgc tctagctgtg aggccaaggcctggtgtttg ggaatactta cgagtcaatc tccatgctct tgtcgttgaa gaactccaac ctgctgagtttcttcatttc aaggaagaac tcgttgatgg agttaagaat ggtaatttca ctcttgagct tgatttcgagccattcaatg cgtctatccc tcgtccaaca ctccacaaat acattggaaa tggtgttgac ttccttaaccgtcatttatc ggctaagctc ttccatgaca aggagagttt gcttccattg cttaagttcc ttcgtcttcacagccaccag ggcaagaacc tgatgttgag cgagaagatt cagaacctca acactctgca acacaccttgaggaaagcag aagagtatct agcagagctt aagtccgaaa cactgtatga agagtttgag gccaagtttgaggagattgg tcttgagagg ggatggggag acaatgcaga gcgtgtcctt gacatgatac gtcttcttttggaccttctt gaggcgcctg atccttgcac tcttgagact tttcttggaa gagtaccaat ggtgttcaacgttgtgatcc tctctccaca tggttacttt gctcaggaca atgttcttgg ttaccctgac actggtggacaggttgttta cattcttgat caagttcgtg ctctggagat agagatgctt caacgtatta agcaacaaggactcaacatt aaaccaagga ttctcattct aactcgactt ctacctgatg cggtaggaac tacatgcggtgaacgtctcg agagagttta tgattctgag tactgtgata ttcttcgtgt gcccttcaga acagagaagggtattgttcg caaatggatc tcaaggttcg aagtctggcc atatctagag acttacaccg aggatgctgcggttgagcta tcgaaagaat tgaatggcaa gcctgacctt atcattggta actacagtga tggaaatcttgttgcttctt tattggctca caaacttggt gtcactcagt gtaccattgc tcatgctctt gagaaaacaaagtacccgga ttctgatatc tactggaaga agcttgacga caagtaccat ttctcatgcc agttcactgcggatattttc gcaatgaacc acactgattt catcatcact agtactttcc aagaaattgc tggaagcaaagaaactgttg ggcagtatga aagccacaca gcctttactc ttcccggatt gtatcgagtt gttcacgggattgatgtgtt tgatcccaag ttcaacattg tctctcctgg tgctgatatg agcatctact tcccttacacagaggagaag cgtagattga ctaagttcca ctctgagatc gaggagctcc tctacagcga tgttgagaacaaagagcact tatgtgtgct caaggacaag aagaagccga ttctcttcac aatggctagg cttgatcgtgtcaagaactt gtcaggtctt gttgagtggt acgggaagaa cacccgcttg cgtgagctag ctaacttggttgttgttgga ggagacagga ggaaagagtc aaaggacaat gaagagaaag cagagatgaa gaaaatgtatgatctcattg aggaatacaa gctaaacggt cagttcaggt ggatctcctc tcagatggac cgggtaaggaacggtgagct gtaccggtac atctgtgaca ccaagggtgc ttttgtccaa cctgcattat atgaagcctttgggttaact gttgtggagg ctatgacttg tggtttaccg actttcgcca cttgcaaagg tggtccagctgagatcattg tgcacggtaa atcgggtttc cacattgacc cttaccatgg tgatcaggct gctgatactcttgctgattt cttcaccaag tgtaaggagg atccatctca ctgggatgag atctcaaaag gagggcttcagaggattgag gagaaataca cttggcaaat ctattcacag aggctcttga cattgactgg tgtgtatggattctggaagc atgtctcgaa ccttgaccgt cttgaggctc gccgttacct tgaaatgttc tatgcattgaagtatcgccc attggctcag gctgttcctc ttgcacaaga tgattgaaag gagatataat ggctaccaatgcaaaacccg tctataaacg cattctgctt aagttgagtg gcgaagctct gcagggcact gaaggcttcggtattgatgc aagcatactg gatcgtatgg ctcaggaaat caaagaactg gttgaactgg gtattcaggttggtgtggtg attggtgggg gtaacctgtt ccgtggcgct ggtctggcga aagcgggtat gaaccgcgttgtgggcgacc acatggggat gctggcgacc gtaatgaacg gcctggcaat gcgtgatgca ctgcaccgcgcctatgtgaa cgctcgtctg atgtccgcta ttccattgaa tggcgtgtgc gacagctaca gctgggcagaagctatcagc ctgttgcgca acaaccgtgt ggtgatcctc tccgccggta caggtaaccc gttctttaccaccgactcag cagcttgcct gcgtggtatc gaaattgaag ccgatgtggt gctgaaagca accaaagttgacggcgtgtt taccgctgat ccggcgaaag atccaaccgc aaccatgtac gagcaactga cttacagcgaagtgctggaa aaagagctga aagtcatgga cctggcggcc ttcacgctgg ctcgtgacca taaattaccgattcgtgttt tcaatatgaa caaaccgggt gcgctgcgcc gtgtggtaat gggtgaaaaa gaagggactttaatcacgga ataa
14、lb液体培养基中的组分为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l，1g/l尿苷，0.5g/l尿苷一磷酸其余为去离子水，ph值自然；
15、lb固体培养基中的组分为酵母粉5g/l、琼脂10g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l，1g/l尿苷，0.5g/l尿苷一磷酸其余为去离子水，ph值自然。
16、优选的，步骤b中发酵培养基的组成：葡萄糖30g/l、硫酸铵42g/l、磷酸二氢钾0.8g/l、七水硫酸镁0.1g/l、甘油10g/l、豆油1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、氯化锰0.01g/l。
17、优选的，步骤c发酵液中的菌体的加入量占转化液体积的10-20od/ml；
18、转化液中atp浓度为1-6mm，poly-p浓度为15-35mm，mg2+的浓度为15-35mm，尿苷二磷酸的浓度为200-400mm。
19、优选的，步骤d中陶瓷膜的孔径为50-250nm，超滤膜的孔径为5000-10000da。
20、优选的，步骤e中的萃取剂为乙酸乙酯，乙醚，石油醚，正丁醇中的一种。
21、优选的，步骤f中强碱性阴离子交换树脂为cl型，其中强碱性阴离子交换树脂的转型方法为：将阴离子树脂进树脂体积的1-2bv的氯化钠溶液，然后用水将里面的氯化钠洗净，然后进1-2bv的盐酸溶液，然后用水洗至流出液的电导率＜20us/cm，树脂类型转为cl型。
22、优选的，步骤f中下层料液的进料流速为1-2bv/h；
23、磷酸钠缓冲液的进料流速为2-3bv/h，进样量为2-3bv；
24、优选的，氯化钠溶液的浓度为0.5-1.0mol/l，洗脱速率为1-2bv/h。
25、优选的，步骤f中下层料液用氢氧化钠调ph至7-8后进强碱性阴离子交换树脂。
26、优选的，步骤g中纳滤膜的过滤孔径为150-300da。
27、由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
28、1.通过在选择培养基中加入0.1％的尿苷和0.5％的尿苷一磷酸，筛选出能够提高尿苷二磷酸转化率的高质量菌体，然后通过在发酵过程中加入钴铵素，使发酵菌量增加的同时，保持聚磷酸激酶和尿苷一磷酸酶的活性。
29、2.转化液依次通过陶瓷膜、超滤膜过滤，再过阳离子树脂柱和氯型阴离子交换树脂进行脱盐和纯化，最后用纳滤膜浓缩和醇沉法得到高纯度的尿苷二磷酸。
30、3.本发明通过优化筛选条件、发酵培养基和转化过程，显著提高了尿苷二磷酸的转化率。
31、4.本发明尿苷二磷酸的产量最高能够达到40g/l，远超现有技术的产量。此外，本方法简化了纯化流程，降低了生产成本，为尿苷二磷酸的大规模生产和应用提供了有力支持。
1.一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于，步骤a中具体的筛选条件为：将含有聚磷酸激酶和尿苷一磷酸激酶的重组大肠杆菌在固体培养基上涂布后，放于37℃环境内培养16h，挑取1～2cm2的菌苔接种于250ml lb液体培养基，37℃、220rpm转速下恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8，得培养菌液；
3.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于，步骤b中发酵培养基的组成：葡萄糖30g/l、硫酸铵42g/l、磷酸二氢钾0.8g/l、七水硫酸镁0.1g/l、甘油10g/l、豆油1g/l、硫酸亚铁0.01g/l、氯化锰0.01g/l。
4.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于：步骤c发酵液中的菌体的加入量占转化液体积的10-20od/ml；
5.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于：步骤d中陶瓷膜的孔径为50-250nm，超滤膜的孔径为5000-10000da。
6.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于，步骤e中的萃取剂为乙酸乙酯，乙醚，石油醚，正丁醇中的一种。
7.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于：步骤f中强碱性阴离子交换树脂为cl型，其中强碱性阴离子交换树脂的转型方法为：将阴离子树脂进树脂体积的1-2bv的氯化钠溶液，然后用水将里面的氯化钠洗净，然后进1-2bv的盐酸溶液，然后用水洗至流出液的电导率＜20us/cm，树脂类型转为cl型。
8.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于：步骤f中下层料液的进料流速为1-2bv/h；
9.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于：步骤f中下层料液用氢氧化钠调ph至7-8后进强碱性阴离子交换树脂。
10.如权利要求1所述的一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于：步骤g中纳滤膜的过滤孔径为150-300da。
