本发明提供了一种抗氧化肽及其制备方法，属于生物。本发明涉及一种寻氏肌蛤抗氧化肽及其制备方法和应用，具体涉及一种寻氏肌蛤抗氧化肽及其制备方法和应用。
背景技术：
1、活性氧在体内的过量堆积会损伤正常细胞和组织中的蛋白质和dna，从而增加人体患高血压、糖尿病、癌症和心血管等疾病的概率。在食品中，食品氧化变质所产生的过氧化物不仅导致不良风味和毒性反应，还影响了食物的营养价值。因此，寻找安全的抗氧化剂以消除体内过量的自由基是目前的研究热点之一。
2、与化学合成的抗氧化剂相比，天然抗氧化剂具毒副作用小且价格低廉的优势。抗氧化肽是一种可通过与体内自由基结合或者调动相关蛋白表达以减少机体的氧化损伤的天然抗氧化剂。植物和动物现已被证明是抗氧化肽的重要来源。
3、我国拥有丰富的贝类资源，寻氏肌蛤(musculus seninousei)俗称海瓜子，是我国沿海地区常见的一种低值贝类，具有价格低廉的特点，但因体积小不方便食用和加工，因此寻氏肌蛤以鲜食为主，加工产品少，利用开发度低。寻氏肌蛤富含大量蛋白质且氨基酸种类丰富，是抗氧化肽提取制备的良好原料。利用现代生物技术对寻氏肌蛤蛋白质资源进行深加工，合理的选用酶类等，通过工艺优化抗氧化肽的产品得率将使得抗氧化肽的研究具有更广阔的前景。
4、202010007720.6一种鳄鱼抗氧化肽复合物及其制备方法和应用。本技术公开一种鳄鱼抗氧化肽复合物，所述鳄鱼抗氧化肽复合物包括：鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5；其中，按照所述鳄鱼抗氧化肽复合物的质量分数计，所述的鳄鱼抗氧化肽1-5的含量分别为0.1％-2％、0.5％-3％、0.1％-2％、0.1％-2％和0.5％-5％，鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量在800da-1500da的范围内。鳄鱼抗氧化肽复合物能够有效清除dpph·自由基、abts+·自由基及羟基(oh-)自由基；所述鳄鱼抗氧化肽复合物对lo2、hacat细胞没有毒害作用，且对过氧化氢诱导的氧化损伤的hacat细胞有修复功能。
5、该技术缺点：
6、(1)该技术在预处理时采用蒸煮法，易使具有抗氧化活性的肽类物质发生变性失活；
7、(2)该技术dpph·自由基清除率最高仅为81.89％，而本发明的寻氏肌蛤抗氧化肽复合物的dpph·自由基清除率高达91.48％。
8、202210737670.6一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片。一种鲢鱼排抗氧化肽及分离方法、鲢鱼排抗氧化肽咀嚼片，本发明以鲢鱼鱼排为原料，通过酶促水解得到鲢鱼排抗氧化肽，采用超滤技术将鲢鱼排酶解液分成<3kda、3-10kda和>10kda三个组分，然后以不同的抗氧化体系来对各组分多肽进行体外抗氧化活性评价，结果表明，<3kda的组分具有最好的dpph自由基清除能力、abts自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和cu2+螯合能力，说明其抗氧化性最好，本发明选择<3kda的抗氧化肽组分进行lc-ms/ms检测，通过串联质谱对其特征离子质子峰进行二级质谱分析，得到其中丰度较高、氨基酸构成符合抗氧化肽特征的9条肽段，分别为gepflpmp、pyligqf、fsfhmhvnganalva、vivydopf、tpikfdoivy、htwtw、tayygpipf、gppgppgp或gppgppgtpgpq。
9、现有技术缺点：
10、(1)所述鲢鱼排抗氧化肽采用两步法酶解，工艺复杂，本发明所述寻氏肌蛤抗氧化肽仅需单一酶一步酶解获得，具有制备过程简单、经济节约的优势。
11、(2)所述鲢鱼排抗氧化肽制备步骤为：酶解-超滤-串联质谱检测肽序，与本发明所述寻氏肌蛤抗氧化肽相比，未进行鲢鱼排抗氧化肽复合物的纯化步骤，所获得的鲢鱼排抗氧化肽纯度不高。
12、(3)所述鲢鱼排抗氧化肽未开展抗氧化细胞模型的验证工作，本发明通过建立细胞抗氧化模型，更深入的验证了所述寻氏肌蛤抗氧化肽对细胞内的丙二醛mda含量、sod抗氧化酶活性和细胞因子il-2、il-4、il-6、il-10影响作用。
13、202410258650.x一种扇贝源抗氧化肽及其制备方法与应用。本发明的扇贝源抗氧化肽包括氨基酸序列，如seq.id.no.1～5所示的肽中的至少一种，从栉孔扇贝中制备筛选获得。其中，对接能量最低的肽sgfpfpp通过dpph法、abts法进行活性初步验证，其抗氧化活性良好。本发明获得的抗氧化肽可应用于食品或药品。
14、现有技术缺点：
15、(1)所述扇贝源抗氧化肽采用先碱性蛋白酶后中性蛋白酶两步法酶解，工艺复杂，本发明所述寻氏肌蛤抗氧化肽仅需单一酶一步酶解获得，具有制备过程简单、经济节约的优势。
16、(2)所述扇贝源抗氧化肽未进行抗氧化细胞模型验证，本发明通过建立细胞抗氧化模型，更深入的验证了所述寻氏肌蛤抗氧化肽对细胞内的丙二醛mda含量、sod抗氧化酶活性和细胞因子il-2、il-4、il-6、il-10影响作用。
17、(3)所述扇贝源抗氧化肽来源于栉孔扇贝肉，原料价格昂贵，而本发明所述寻氏肌蛤抗氧化肽，来源于寻氏肌蛤肉，价格低且无加工产品，具有低值水产品的高质化开发利用的优势。
18、(4)所述扇贝源抗氧化肽抗氧化活性评分最高为0.55，本发明所述寻氏肌蛤抗氧化肽抗氧化活性评分最高可达0.88，抗氧化活性评分明显优于扇贝源抗氧化肽。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供一种寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法及其应用，通过分离纯化和鉴定得到7种高抗氧化活性的小分子抗氧化肽，所述抗氧化肽无毒且易于消化吸收和利用，为寻氏肌蛤的综合利用提供了一种精深加工技术，以达到低值水产品的高值化利用目的。
2、本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
3、作为发明的第一方面，一种寻氏肌蛤抗氧化肽，其特征在于：包含氨基酸序列seq.id.no.1～7所示肽中的至少一种；所述寻氏肌蛤抗氧化肽1～7的氨基酸序列如seq.id.no.1～7所示，其中，所述寻氏肌蛤抗氧化肽1的氨基酸序列seq.id.no.1：ppappprppq；所述寻氏肌蛤抗氧化肽2的氨基酸序列seq.id.no.2：wddmekiwhhtf；所述寻氏肌蛤抗氧化肽3的氨基酸序列seq.id.no.3：fapdkhekf；所述寻氏肌蛤抗氧化肽4的氨基酸序列seq.id.no.4：tgppgepgtpgl；所述寻氏肌蛤抗氧化肽5的氨基酸序列seq.id.no.5：nqfpgfkevrl；所述寻氏肌蛤抗氧化肽6的氨基酸序列seq.id.no.6：gfagddapra；所述寻氏肌蛤抗氧化肽7的氨基酸序列seq.id.no.7：gqavqpgprq。
4、所述的一种寻氏肌蛤抗氧化肽，所述寻氏肌蛤抗氧化肽的分子量为900da～1700da。
5、作为发明的第二方面，一种寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
6、(1)寻氏肌蛤肉的酶解；
7、(2)寻氏肌蛤肉抗氧化肽的制备；
8、(3)寻氏肌蛤肉抗氧化肽的纯化；
9、(4)寻氏肌蛤肉抗氧化肽的氨基酸序列测定。
10、步骤(1)中，酶解条件为：ph为5.5～10.5、温度30～60℃、酶解时间为20～360min、酶-底物配比为400～1600u/g；所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶。
11、步骤(2)中，以寻氏肌蛤肉为原料提取蛋白，酶解超滤后以sephadex g-25为分离介质，进行凝胶层析分离纯化，冷冻干燥得到抗氧化肽。
12、步骤(2)中，将上述酶解液采用分子量截留范围为10000da、5000da和1000da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为4个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10000da的组分、分子量介于5000da和10000da的组分、分子量介于1000da和5000da的组分、分子量小于1000da的组分，以dpph·自由基清除率为指标进行评价。
13、步骤(3)中，寻氏肌蛤肉抗氧化肽的纯化：收集具有最佳抗氧化活性的级分，经0.45μm滤膜过滤后，以sephadex g-25为分离介质进行凝胶色谱分离，洗脱液为超纯水，流速为0.5ml/min,测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性，冷冻干燥得到的高纯度抗氧化肽。
14、步骤(4)中，寻氏肌蛤肉抗氧化肽的氨基酸序列测定：收集吸收峰对应的洗脱组分纯化的峰ⅱ，利用lc-ms/ms测定氨基酸序列。
15、作为发明的第三方面，一种寻氏肌蛤抗氧化肽的应用，其特征在于：所述寻氏肌蛤抗氧化肽在保健品、食品添加剂或化妆品的应用。
16、所述寻氏肌蛤抗氧化肽对dpph·自由基和abts·+自由基具有良好的清除作用；在细胞抗氧化研究中，能降低细胞内的丙二醛mda含量，提高sod抗氧化酶活性，且有效抑制氧化损伤细胞中的细胞因子il-2、il-4、il-6、il-10含量。
17、本发明的有益效果：
18、本发明采用寻氏肌蛤抗氧化肽对dpph·自由基和abts·+自由基具有良好的清除作用。在细胞抗氧化研究中，能不同程度的降低细胞内的丙二醛mda含量，提高sod抗氧化酶活性，且有效抑制氧化损伤细胞中的细胞因子(il-2、il-4、il-6、il-10)含量。
19、本发明的优势主要为以下几点：
20、(1)本发明的抗氧化肽序列为首次报道，与已经公开的抗氧化肽序列均不一样。
21、(2)本发明所述寻氏肌蛤抗氧化肽仅需单一酶一步酶解获得，具有制备过程简单、经济节约的优势。
22、(3)本发明所述寻氏肌蛤抗氧化肽分子量为900da～1700da，低分子量的抗氧化肽更有利于人体消化吸收。
23、(4)寻氏肌蛤原料价格低且无加工产品，本发明所述抗氧化肽为寻氏肌蛤综合利用提供了一种精深加工技术，具有低值水产品的高值化利用优势。
24、(5)本发明所述的7种抗氧化肽，其结构组成及其理化性质(等电点、疏水性、抗氧化活性等)均区别于已公开发明专利。通常多肽序列结构和性质的差异决定其功效，因此，本发明具有创新性。
1.一种寻氏肌蛤抗氧化肽，其特征在于：包含氨基酸序列seq.id.no.1～7所示肽中的至少一种；
2.根据权利要求1所述的一种寻氏肌蛤抗氧化肽，其特征在于：所述寻氏肌蛤抗氧化肽的分子量为900da～1700da。
3.一种如权利要求1所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
4.根据权利要求3所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，酶解条件为：ph为5.5～10.5、温度30～60℃、酶解时间为20～360min、酶-底物配比为400～1600u/g；所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶的任一种。
5.根据权利要求3所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，以寻氏肌蛤肉为原料提取蛋白，酶解超滤后以sephadex g-25为分离介质，进行凝胶层析分离纯化，冷冻干燥得到抗氧化肽。
6.根据权利要求4所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，将上述酶解液采用分子量截留范围为10000da、5000da和1000da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为4个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10000da的组分、分子量介于5000da和10000da的组分、分子量介于1000da和5000da的组分、分子量小于1000da的组分，以dpph·自由基清除率为指标进行评价。
7.根据权利要求3所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，寻氏肌蛤肉抗氧化肽的纯化：收集具有最佳抗氧化活性的级分，经0.45μm滤膜过滤后，以sephadex g-25为分离介质进行凝胶色谱分离，洗脱液为超纯水，流速为0.5ml/min,测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性，冷冻干燥得到的高纯度抗氧化肽。
8.根据权利要求3所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，寻氏肌蛤肉抗氧化肽的氨基酸序列测定：收集吸收峰对应的洗脱组分纯化的峰ⅱ，利用lc-ms/ms测定氨基酸序列。
9.一种如权利要求1所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的应用，其特征在于：所述寻氏肌蛤抗氧化肽的任一种或复合物在功能性食品、保健品、食品添加剂及化妆品领域的应用。
10.根据权利要求9所述的寻氏肌蛤抗氧化肽的应用，其特征在于：所述寻氏肌蛤抗氧化肽对dpph·自由基和abts·+自由基具有清除作用；
