本发明涉及药品分析领域，尤其涉及一种基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法及成分含量测定方法。
背景技术：
1、抗栓再造丸由红参、黄芪、胆南星、穿山甲(烫)、牛黄、冰片、水蛭(烫)、麝香、丹参、三七、大黄、地龙、苏合香、全蝎、葛根、穿山龙、当归、牛膝、何首乌、乌梢蛇、桃仁、朱砂、红花、土鳖虫、天麻、细辛、威灵仙、草豆蔻、甘草等多种成分组成。其具有活血化瘀，舒筋通络，熄风镇痉的作用，可以用于治疗中风后遗症恢复期的手足麻木，步履艰难，瘫痪，口眼歪斜，言语不清等症状。
2、抗栓再造丸化学成分复杂，目前关于抗栓再造丸的质量标准主要是薄层鉴别项目，尚未建立特征图谱检查方法及标准，无法较全面反应抗栓再造丸的质量，不能保证对抗栓再造丸的质量进行全面准确控制。
技术实现思路
1、本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，利于较为全面有效的控制抗栓再造丸的质量。
2、本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
3、一种基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，包括如下步骤：
4、s1对照品溶液的制备：精密称取葛根素、大豆苷、大黄素甲醚对照品适量，分别加适量30%乙醇、70%甲醇、甲醇溶解，配制对照品母液，之后分别取对照品母液葛根素1ml、大豆苷0.5ml、大黄素甲醚3ml于同一容量瓶中加甲醇定容，制成混合对照品溶液；
5、s2供试品溶液的制备：精密称取抗栓再造丸粉末适量，加甲醇溶解，称重，回流提取，称重，用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，取滤液即为供试品溶液；
6、s3高效液相色谱条件的确定：采用c18色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05%磷酸溶液为流动相b，梯度洗脱条件为：0-18min，5%-12%a；18-23min，12% a；23-24min，12%-18%a；24-39min，18%-23%a；39-43min，23%-50%a；43-75min，50%-70%a；流速为0.2-0.32ml/min；柱温为29-31℃；检测波长为286nm；进样量为1μl；
7、s4高效液相色谱测定：按照步骤s3中的色谱条件采集对照品溶液及多批供试品溶液的色谱图，对色谱图进行分析，确认共有峰11个，并指认出3个成分的特征峰，其中，1号峰为葛根素，4号峰为大豆苷，9号峰为大黄素甲醚；
8、s5预测保留时间的确定：采用多根不同品牌及类型的色谱柱，按照步骤s3中的色谱条件采集混合对照品溶液及供试品溶液的色谱图，得到11个共有峰的标准保留时间；以大豆苷、大黄素甲醚为双标对照品，采用双标线性校正法求得其余峰的预测保留时间。
9、进一步的，供试品溶液的制备方法具体为：精密称取抗栓再造丸0.3g，加入甲醇25ml，称重量，回流提取1h，称重，用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，取滤液即为供试品溶液。
10、进一步的，精密称取葛根素、大豆苷、大黄素甲醚对照品适量，分别加适量30%乙醇、70%甲醇、甲醇溶解，制成浓度为691.45、484.62、77.22μg•ml-1的对照品母液；分别取对照品母液葛根素1ml、大豆苷0.5ml、大黄素甲醚3ml于同一5ml容量瓶中，加入甲醇定容至5ml，制成浓度为138.29、48.46、46.33μg•ml-1的混合对照品溶液。
11、进一步的，步骤s5中，采用双标线性校正法求得预测保留时间的具体方法为：以双标对照品大豆苷、大黄素甲醚色谱峰的实际保留时间作为纵坐标、标准保留时间为横坐标，得到线性拟合方程；将其余9个特征峰的标准保留时间代入方程，得到对应的预测保留时间；其中，标准保留时间为多根色谱柱上采集得到的供试品保留时间的平均值。
12、进一步的，步骤s5中，11个峰的标准保留时间依次分别为12.167 min、13.907min、15.395 min、16.256min、22.324 min、31.898 min、33.792 min、50.789min、53.465min、55.449 min、56.499 min。
13、进一步的，步骤s3中，选择流速为0.3ml/min；柱温为30℃。
14、本申请还提供了一种抗栓再造丸的成分含量测定方法，包括如下步骤：按照所述建立方法的步骤s1-s3进行液相色谱测定，得到色谱图，基于外标法通过峰面积计算葛根素、大豆苷、大黄素甲醚各成分的含量。
15、关于抗栓再造丸的质量控制方式如下：按照步骤s1的方法制备大豆苷和大黄素甲醚的双标混合对照品溶液，按照步骤s2的方法制备供试品溶液，按照步骤s3的色谱条件采集两者色谱，通过确定的预测保留时间定位各待测成分的色谱峰，即观察各成分在预测保留时间是否出峰。
16、其中，双标混合对照品溶液的具体制备方法如下：取大豆苷对照品母液0.5ml、大黄素甲醚对照品母液3ml于同一5ml容量瓶中，加入甲醇定容至5ml，制成浓度为48.46、46.33μg•ml-1的混合对照品溶液。
17、本发明采用上述结构，所具有的优点是：
18、1、本申请基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，以大豆苷、大黄素甲醚为双标对照品，采用双标线性校正法用2个对照品对其他9个成分的色谱峰进行有效的预测和定位，基于多点线性回归校正，在色谱柱的适用率及预测的准确率上都明显优于目前普遍用于色谱峰定性的相对保留时间法，大大地消除了相对保留时间法的特征峰定性准确率及色谱柱适用率不够高的问题，在科学准确性及耐用性上表现良好，且较经济，提高了实验的简便性又降低了成本；为抗栓再造丸的质量控制提供了参考和依据。
19、2、该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优势。
20、3、根据本申请建立方法所得特征图谱，具有11个有效分离的特征峰，因此获得的特征图谱能较为有效地表征抗栓再造丸的质量，进而利于较全面监控药物的质量。
1.一种基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法具体为：精密称取抗栓再造丸0.3g，加入甲醇25ml，称重量，回流提取1h，称重，用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，取滤液即为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，其特征在于，精密称取葛根素、大豆苷、大黄素甲醚对照品适量，分别加适量30%乙醇、70%甲醇、甲醇溶解，制成浓度为691.45、484.62、77.22μg•ml-1 的对照品母液；分别取对照品母液葛根素1ml、大豆苷0.5ml、大黄素甲醚3ml于同一5ml容量瓶中，加入甲醇定容至5ml，制成浓度为138.29、48.46、46.33μg•ml-1的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，其特征在于，步骤s5中，采用双标线性校正法求得预测保留时间的具体方法为：以双标对照品大豆苷、大黄素甲醚色谱峰的实际保留时间作为纵坐标、标准保留时间为横坐标，得到线性拟合方程；将其余9个特征峰的标准保留时间代入方程，得到对应的预测保留时间；其中，标准保留时间为多根色谱柱上采集得到的供试品保留时间的平均值。
5.根据权利要求1所述的基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，其特征在于，步骤s5中，11个峰的标准保留时间依次分别为12.167 min、13.907 min、15.395 min、16.256 min、22.324 min、31.898 min、33.792 min、50.789 min、53.465 min、55.449 min、56.499 min。
6.根据权利要求1所述的基于双标线性法的抗栓再造丸高效液相特征图谱的建立方法，其特征在于，步骤s3中，选择流速为0.3ml/min；柱温为30℃。
7.一种抗栓再造丸的成分含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：按照权利要求1-6所述建立方法的步骤s1-s3进行液相色谱测定，得到色谱图，基于外标法通过峰面积计算葛根素、大豆苷、大黄素甲醚各成分的含量。
