本发明涉及生物，具体涉及一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用，特别是在眼部疾病中的应用。
背景技术：
1、由细胞释放到细胞外或血浆中而进入血液循环、被称为“细胞外囊泡”（extracellular vesicles， evs）的细胞分泌物已经得到了广泛的关注和研究。“细胞外囊泡”主要分为外泌体（exosome）、微泡（microvesicle）或微颗粒（microparticle）和凋亡小体（apoptotic body）三类，其中主要成分是外泌体。目前，外泌体被广泛用于多种损伤修复及免疫性疾病的治疗。然而，外泌体其细胞靶向性仍需进一步提高，以减少副作用和提升疗效。其次，细胞分泌外泌体的效率有限，收集一定量的外泌体需要投入大量时间。因此，进一步提升其靶向性、生物安全性和产量是未来需要解决的问题。
2、细胞纳米囊泡的修饰策略包括基因工程和化学修饰。利用基因工程将目的蛋白或多肽的基因序列与选定的外泌体表面蛋白的基因序列融合，可使目的蛋白或引导肽表达于外泌体表面。溶酶体相关膜蛋白2b（lysosome associated membrane protein 2b,lamp2b）是lamp家族成员，是一种可用于携带靶向蛋白或多肽的膜蛋白。
3、另外，在细胞内还存在大量纳米囊泡，游离在各种富有膜的细胞器之间，介导细胞内物质运输及细胞的分泌途径。其中构成型分泌囊泡是细胞内囊泡（intracellularvesicle，ivs）的主要类型，由内质网产生，与高尔基体、溶酶体和细胞膜等进行物质交换，介导了细胞内各种分泌蛋白的产生、运输及分泌。其内容物丰富，含有大量的分泌型蛋白、脂质和核酸分子。迄今没有关于如何对细胞内纳米囊泡进行富集和应用的报道。除此之外，我们前期结果中发现相较于evs，这些细胞内纳米囊泡粒径更小，跨膜蛋白lamp2b含量更多，具有更高的药物递送效率，更适合用于疾病治疗及其药物递送。
4、自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis）是一类常见致盲性眼病，主要累及葡萄膜和视网膜，可引起白内障、青光眼、黄斑病变和视神经萎缩等多种眼部并发症，导致视力严重下降。cd4阳性辅助性t细胞（t helper cells, th cells），特别是分泌ifn-γ的th1和分泌il-17a的th17细胞，是自身免疫葡萄膜炎的主要效应t细胞，它们的异常激活在疾病发生中发挥重要致病作用。cd40l属于tnf超家族，被认为是cd4 + t淋巴细胞的早期激活标记。cd40/cd40l参与触发下游多种免疫信号通路，早期研究已证明cd40/cd40l共刺激信号传导是产生t细胞依赖性抗体应答和记忆b细胞分化所必需。巨噬细胞和dc细胞中cd40/cd40l信号激活后，诱导细胞因子分泌和表面活化分子表达，参与调节cd4 + t细胞和cd8 +t细胞交叉刺激和激活。在各种自身免疫性疾病中也存在cd40/cd40l信号通路表达调控失调，其可能促进致病性自身免疫反应的启动或维持。因此，靶向cd40/cd40l通路有望成为自身免疫性疾病新的治疗策略。
5、病理性视网膜新生血管（retinal neovascularization，rnv）是几种常见致盲性视网膜疾病的关键病理变化，包括糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, dr)、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,rop) 等。目前的临床治疗包括玻璃体内注射anti-vegf药物、视网膜光凝和玻璃体切割，尽管玻璃体内注射anti-vegf药物可以抑制视网膜和脉络膜nv的进一步形成，但其治疗效果一直存在争议，大约30%的患者对anti-vegf药物治疗的反应不佳，并且激光和手术治疗效果有限，仍有相当数量的患者丧失视功能。因此，需要寻找更有效、更安全的替代方法。
6、既往研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cell, msc）具有促进创伤修复、神经保护等作用，广泛用于视网膜和神经系统疾病的治疗研究。但由于其具有细胞增殖的劣势限制了其临床转化及应用。msc衍生的囊泡具有干细胞的生物学特性，无核无遗传物质，具有极大的转化应用前景。对囊泡进行改造，使其具备靶向性可以提高囊泡的生物利用率。因此，对细胞内纳米囊泡进行针对性改造，使其具备靶向性，进行自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病研究，并寻找治疗自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病药物具有重要意义。
技术实现思路
1、为克服现有技术的不足，本发明提供了一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用，特别是作为具有靶向功能的药物载体的应用。
2、在本发明第一方面，提供一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡，其过表达靶向分子-lamp2b的融合蛋白。
3、具体地，所述的靶向分子包括但不仅限于多肽、抗体、激活或抑制受体、蛋白配体、生物活性酶、核酸药物、或其组合，特别是，所述的靶向分子为多肽。
4、在本发明的一些实施例中，所述的靶向分子为a25多肽，所述的细胞内纳米囊泡可靶向t细胞。
5、在本发明的一些实施例中，所述的靶向分子为rgd多肽，所述的细胞内纳米囊泡可靶向新生血管（例如视网膜新生血管）。
6、具体地，所述的靶向分子位于lamp2b的n端。
7、具体地，所述的融合蛋白结构包括：
8、1）lamp2b的n端-靶向分子-lamp2b的c端；
9、2）靶向分子-lamp2b的n端。
10、具体地，所述囊泡呈圆球形或者杯垫状。
11、具体地，所述囊泡的平均粒径为50-100nm（例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100nm），特别是65-85nm。
12、具体地，所述的细胞来源于哺乳动物，特别是人类。
13、具体地，所述细胞为真核细胞，特别是干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞（293t）、巨噬细胞、t细胞和肿瘤细胞中的至少一种；更具体地，所述干细胞为间充质干细胞（msc），包括但不限于：脐带间充质干细胞（uc-msc）、骨髓间充质干细胞（bm-msc）、脂肪间充质干细胞（ad-msc）、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。
14、在本发明的一些实施例中，所述细胞为间充质干细胞，特别是脐带间充质干细胞（uc-msc）。
15、在本发明的一些实施例中，所述细胞为上皮细胞，例如293t细胞。
16、在本发明的一些实施例中，所述细胞为肿瘤细胞，例如hela细胞。
17、具体地，所述囊泡由本发明第二方面所述方法制备得到。
18、在本发明第二方面，提供一种上述囊泡的制备方法。
19、具体地，所述的方法包括将过表达靶向分子-lamp2b的融合蛋白的细胞依次进行超声处理、离心处理、超速离心处理的步骤。
20、具体地，所述方法包括以下步骤：
21、（1）将编码靶向分子-lamp2b的融合蛋白的核苷酸引入细胞；
22、（2）取步骤（1）所得细胞分散在悬浮溶剂中，进行超声处理；
23、（3）将步骤（2）所得液体进行一次或多次离心处理，弃去细胞膜及细胞器碎片，取上清液；
24、（4）将步骤（3）所得上清液进行超速离心处理，取沉淀为细胞内纳米囊泡；
25、任选地，（5）将步骤（4）所得沉淀重悬。
26、具体地，步骤（1）中所述将编码靶向分子-lamp2b的融合蛋白的核苷酸引入细胞的方法可以采用转化、转导、转染、感染等方法，可通过载体将该核苷酸引入细胞，所述载体包括质粒载体和病毒载体，所述病毒载体可以为，例如逆转录载体、慢病毒载体或其他载体（例如腺病毒载体、腺相关病毒载体）。
27、在本发明的一些实施例中，步骤（1）包括：构建过表达靶向分子-lamp2b的融合蛋白的质粒，然后将所述质粒包装成慢病毒，将所述慢病毒转染细胞。
28、在本发明的一个实施例中，所述构建过表达质粒的步骤包括：将编码a25肽和lamp2b的cdna片段插入载体质粒中cmv启动子的下游。
29、具体地，步骤（2）中所述细胞为经过培养、消化、洗涤后所得分离的细胞（其经过弃去细胞培养基、消化、洗涤等步骤，可排除分离获得细胞外囊泡的可能性）。
30、具体地，所述方法还可以细胞消化、计数步骤；在本发明的一些实施例中，所述细胞消化步骤包括：培养细胞生长至90%融合，弃去细胞培养基，洗涤细胞，加入胰酶消化细胞，然后中和并清洗细胞。
31、具体地，所述细胞在悬浮溶剂中的细胞密度为1-4×106个/ml，例如1×106个/ml、2×106个/ml、3×106个/ml、4×106个/ml。在本发明的一些实施例中，所述细胞密度为1×106个/ml。
32、具体地，所述悬浮溶剂为任何适于培养细胞的缓冲液，例如pbs、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液。在本发明的一些实施例中，所述溶剂为pbs。
33、具体地，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-35%（例如20%、25%、30%、35%），例如20%-30%。
34、具体地，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-25%（例如20%、22%、24%、25%）；在本发明的一些实施例中，所述超声处理的振幅为20%。
35、具体地，步骤（2）中所述超声处理的时间为10-60s（例如10、15、20、25、30、60s），例如10-30s。
36、具体地，步骤（2）中所述超声处理的时间为10-20s（例如10、15、18、20s），优选为15s；在本发明的一些实施例中，所述超声处理的时间为15s，on 2s，off 2s。
37、在本发明的一些实施例中，步骤（3）中所述离心处理的次数为两次，其各自参数分别为：
38、1000-3000g（例如1000、1500、2000、2500、3000g），5-20分钟（例如5、8、10、12、15、20分钟）；
39、10000-30000g（例如10000、15000、20000、25000、30000g），20-40分钟（例如20、25、28、30、32、35、40分钟）。
40、在本发明的一个实施例中，第一次离心在2000g下进行10分钟。
41、在本发明的一个实施例中，第二次离心在20000g下进行30分钟。
42、具体地，步骤（4）中所述超速离心处理的参数包括100000-180000g（例如100000、120000、140000、150000、160000、180000），50-100分钟（例如50、60、65、70、75、80、90、100分钟）。
43、在本发明的一个实施例中，所述超速离心在150000g下进行70分钟。
44、具体地，步骤（5）中所述重悬溶剂为任何适于培养细胞的缓冲液，例如pbs、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液。在本发明的一些实施例中，所述重悬溶剂为pbs。
45、具体地，所述超声处理、离心处理、超速离心处理中的一种或多种在低温下操作，例如0-5℃下；特别是，所述超声处理、离心处理、超速离心处理均在冰上进行。
46、在本发明的一些实施例中，所述方法包括：取1×106个/ml密度的细胞悬液，将超声探头放入液面中央，超声振幅参数范围是20%，时间参数范围是15s，on 2s，off 2s，进行超声处理；然后将该液体转移至离心管进行离心，离心参数是2000g×10min，20000g×30min，收集上清液；将该上清液转移至超速离心管进行离心，离心参数是150000g×70min。
47、在本发明第三方面，提供第一方面所述的囊泡作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
48、在本发明的一个优选实施方案中，所述疾病为眼部疾病，特别是葡萄膜或视网膜相关疾病，包括，但不限于，葡萄膜炎，例如自身免疫性葡萄膜炎；视网膜血管病，例如视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、早产儿视网膜病变等；黄斑疾病，例如中心性浆液性脉络膜视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、黄斑囊样水肿、黄斑裂孔黄斑前膜等；视网膜脱离疾病，例如孔源性视网膜脱离、牵拉性视网膜脱离、渗出性视网膜脱离等；视网膜色素变性；视网膜肿瘤疾病，例如视网膜母细胞瘤等；以及其他眼部疾病，例如青光眼、干眼症、其他眼部炎性疾病（例如睑缘炎、睑缘角膜结膜炎、结膜炎、角膜炎、视神经炎等）、视神经损伤（例如视神经炎、视神经萎缩、视神经乳头水肿、缺血性视神经病变等）、眼部肿瘤，等。
49、具体地，眼部肿瘤包括任何眼部组织或任何眼部细胞的肿瘤，包括，但不仅限于，脉络膜肿瘤、结膜肿瘤、眼睑肿瘤、浸润性眼内肿瘤、虹膜肿瘤、转移性眼部肿瘤、视神经肿瘤、眼眶肿瘤及视网膜肿瘤。更具体地，包括，但不仅限于，脉络膜肿瘤，如脉络膜血管瘤、脉络膜黑色素瘤、脉络膜转移瘤、脉络膜痣、脉络膜骨瘤、睫状体黑色素瘤和 ota痣；结膜肿瘤，如结膜卡波西氏肉瘤、眼球表面皮样囊肿、结膜淋巴瘤、非典型性的黑色素瘤和 pam、染色结膜肿瘤、睑裂黄斑、翼状胬肉、鳞状细胞癌及结膜上皮内瘤；眼睑肿瘤，如基底细胞癌、毛细血管瘤、汗腺囊瘤、睑缘痣、脂溢性角化病、眼睑恶性黑色素瘤、眼睑皮脂腺癌和眼睑鳞状细胞癌；浸润性眼内肿瘤，如慢性淋巴性白血病、眼睑肿瘤，脉络膜及眼内淋巴瘤；浸润性脉络膜病和眼内淋巴瘤；虹膜肿瘤，如前段葡萄膜转移瘤、虹膜囊肿、虹膜黑色素细胞瘤、虹膜黑色素瘤和虹膜珍珠状囊肿；转移性眼部肿瘤，如转移性脉络膜黑色素瘤 ；视神经肿瘤，如影响视神经的脉络膜黑色素瘤、视神经病变的乳头周围转移瘤、视神经黑色素细胞瘤和视神经鞘脑膜瘤；眼眶肿瘤，如泪腺的腺样囊性癌、眼眶的海绵状血管瘤、眼眶的淋巴管瘤、眼眶黏液囊肿、眼眶炎性假瘤、眼眶横纹肌肉瘤、儿童眼周血管瘤及硬化型炎性假瘤；视网膜肿瘤，如视网膜色素上皮(rpe)增生、视网膜色素上皮(rpe)肿瘤、成视网膜细胞瘤、vonhippel血管瘤。
50、在本发明的一些实施例中，所述囊泡为a25-lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡（sivs-a25），所述疾病为自身免疫性葡萄膜炎。
51、在本发明的一些实施例中，所述囊泡为rgd-lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡（sivs-rgd），所述疾病为视网膜新生血管疾病，例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变。
52、具体地，所述囊泡作为药物载体负载药物活性成分，例如针对上述眼部疾病的药物活性成分；所述药物活性成分包括化学药物（例如雷帕霉素、甲氨蝶呤）、生物药物（例如蛋白质（如pedf、lucentis）、多肽（如kv11、pedf34mer、pedf p5-3）、寡核苷酸类药物（如sirna））、天然药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗和光动力治疗药物中的一种或几种。
53、具体地，所述多肽和蛋白类药物可以为，例如细胞因子(如白细胞介素(如il-1、il-2、il-6、il-10、il-11)、集落刺激因子(如粒细胞集落刺激因子(g-csf)和巨噬细胞集落刺激因子(m-csf))、干扰素(如α、β、γ干扰素)、生长因子（例如色素上皮衍生因子）、肿瘤坏死因子(如tnf-α和tnf-β)、转化生长因子-β家族或趋化因子家族等)、人血红蛋白、凝血因子、血管内皮生长因子抗体拮抗剂、蛋白类激素(如胰岛素、胰高血糖素、降钙素、下丘脑激素、垂体激素或胃肠激素等)、抗体(如单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体或抗体片断)、酶及辅酶类药物(苯丙氨酸裂解酶、精氨酸酶、精氨酸脱酰酶、胰核糖核酸酶、超氧化物歧化酶、天冬酰胺酶、葡糖脑苷脂酶或透明质酸酶)、其他多肽类药物（例如kv11、pedf34mer、pedf p5-3等）。
54、在本发明的一些实施例中，所述囊泡为sivs-a25，所述药物活性成分可以为激素、免疫抑制类药物（雷帕霉素，甲氨蝶呤）、sirna、蛋白（如il-10）和多肽。
55、在本发明的一些实施例中，所述囊泡为sivs-rgd，所述药物活性成分可以为sirna、蛋白（如pedf、lucentis）、多肽（如kv11、pedf34mer、pedf p5-3）。
56、具体地，所述的载药方法可以为基因工程法、化学合成法、病毒载体法、超声法、电穿孔法、共孵育法中的一种或多种方法的组合。
57、具体地，所述药物可以采用任何合适的给药方式，特别是眼内给药，例如滴眼液给药、眼膏给药、眼球后注射给药、眼球旁注射给药、结膜下注射给药、玻璃体腔注射给药，特别是玻璃体腔注射给药。
58、具体地，所述药物可以被配制为任何合适的制剂形式，例如，但不限于，霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、注射剂、粉针剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、眼罩或隐形眼镜等，特别是注射剂。
59、在本发明第四方面，提供一种载药囊泡的制备方法，其包括以本发明第一方面所述的囊泡作为药物载体进行载药。
60、具体地，所述的载药方法可以为基因工程法、化学合成法、病毒载体法、超声法、电穿孔法、共孵育法中的一种或多种方法的组合，特别是共孵育法。
61、具体地，所述载药步骤包括：将所述囊泡与药物活性成分混合，温育；
62、任选地，（通过例如超滤离心）去除游离的药物活性成分。
63、具体地，所述温育温度为35-40℃（例如35、36、37、38、39、40℃），特别是37℃。
64、具体地，所述温育的温育时间为1-2小时（例如1、1.2、1.5、2小时），特别是1小时。
65、在本发明的一些实施例中，超滤膜参数为100kd。
66、具体地，所述载药囊泡的制备方法还可以包括本发明第一方面所述制备囊泡的方法步骤。
67、在本发明第五方面，提供一种载药囊泡，其以本发明第一方面所述的囊泡作为药物载体。
68、具体地，所述载药囊泡中的药物如本发明第三方面所述。
69、具体地，所述载药囊泡的载药率可以为40%-90%（例如45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%）。
70、具体地，所述载药囊泡的包封率可以为40%-90%（例如45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%）。
71、具体地，所述载药囊泡的制备方法可以如本发明第四方面所述。
72、在本发明第六方面，提供一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用载药的第一方面所述的囊泡（例如本发明第四方面所述的载药囊泡）的步骤。
73、特别是，所述疾病优选为眼部疾病，如本发明第三方面所述。
74、具体地，所述受试者为哺乳动物，特别是人类。
75、具体地，所述囊泡作为药物载体负载药物活性成分，例如针对上述眼部疾病的药物活性成分；所述药物活性成分包括化学药物、生物药物、天然药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗和光动力治疗药物中的一种或几种。
76、具体地，所述施用可以采用任何合适的给药方式，特别是眼内给药或静脉注射，所述的眼内给药包括滴眼液给药、眼膏给药、眼球后注射给药、眼球旁注射给药、结膜下注射给药、玻璃体腔注射给药，特别是玻璃体腔注射给药。在本发明的一些实施例中，采用静脉注射治疗自身免疫性葡萄膜炎，采用玻璃体腔给药治疗视网膜新生血管疾病。
77、本发明提供了一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用。发明人通过制备了lamp2b-rgd过表达修饰的细胞内纳米囊泡sivs-rgd和a25-lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡sivs-a25，赋予了原本不具有靶向功能的囊泡分别靶向新生血管和t细胞的作用。进一步利用具有靶向功能的sivs-rgd和sivs-a25作为载体将药物运输至治疗靶点，用于治疗自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病。本发明所述细胞内纳米囊泡产量大，靶向性强，粒径小，粒径分布范围窄，作为载体负载药物时具有更高的包封率和载药率，在玻璃体腔注药方式下分布的范围和程度更广。本发明获得的改造囊泡既可以增强其本身的治疗作用，又可以作为药物载体，具有非常好的应用前景和研究价值。
1.一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：构建过表达靶向分子-lamp2b的融合蛋白的质粒，然后将所述质粒包装成慢病毒，将所述慢病毒转染细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自：多肽、抗体、激活或抑制受体、蛋白配体、生物活性酶、核酸药物、或其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子为多肽。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自a25多肽或rgd多肽。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子位于lamp2b的n端。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-25%，和/或，所述超声处理的时间为10-20s。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%；和/或，所述超声处理的时间为15s，on 2s，off 2s。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述离心处理的次数为两次，
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞、巨噬细胞、t细胞和肿瘤细胞中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，所述间充质干细胞包括：脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。
12.根据权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡。
13.根据权利要求12所述的囊泡，其特征在于，所述囊泡为a25-lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡或rgd-lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡。
14.根据权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述疾病为眼部疾病。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述疾病为自身免疫性葡萄膜炎或视网膜新生血管疾病。
17.一种载药囊泡的制备方法，其包括以权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体进行载药。
18.一种载药囊泡，其以权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体。
