本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种芋螺肽的规模化合成与纯化方法。
背景技术：
1、芋螺肽(conotoxinctx)，又叫芋螺毒素肽。是一类小分子多肽，属神经毒素。芋螺肽是腹足纲芋螺科的肉食性海洋软体动物所分泌的毒液中的一种成分，是芋螺对猎物进行麻痹捕食和防御外敌的武器，每种芋螺毒液中可能含50～200种不等的小分子多肽。
2、芋螺肽为信号肽介导表达的小分子多肽，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，大多由12～46个氨基酸残基组成，且含有2对或3对二硫键，其高密度的二硫键结构使得其稳定性大大提高，从而使得芋螺肽在各种理化环境中仍能很好的保持活性。
3、芋螺肽，英文名为mu-conotoxin，具体肽序如下：pglu1-gly2-cys3-cys4-asn5-gly6-pro7-lys8-gly9-cys10-ser11-lys12-ser13-trp14-cys15-arg16-asp17-his18-ala19-arg20-cys21-cys22-nh2,二硫键位于cys3-cys15、cys4-cys21和cys10-cys22位置。
4、目前芋螺肽制备方式主要有三种，分别是生物组织提取法、化学合成法、基因工程制备。其中，生物组织提取产量受限，从芋螺体内直接分离提取芋螺毒素的工艺复杂，提取困难，成本高；基因工程制备工艺并不成熟，两者均难以实现芋螺毒素的产业化，并不能满足市场的需求。因此，需要通过固相多肽合成法大量合成，降低成本，以此满足科研用途及日益增长的市场需求。
5、现有技术如公开号cn110894225a公开了一种芋螺肽的规模化制备方法，该方法按照芋螺肽主链c端至n端的氨基酸顺序依次偶联肽树脂，裂解后采用空气氧化法合成三对二硫键，最后纯化制备得到产品。该方法采用空气氧化，反应时间过长，且最终的收率只有10%。
6、专利cn116655765a公开了一种芋螺毒素的液相合成方法，其以2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇为载体，包括以fmoc-cys(mebzl)-oh为起始氨基酸经活化后与载体酯化缩合形成fmoc-cys(mebzl)-shs；脱除fmoc保护基后与活化后的fmoc-cys(acm)-oh缩合，继续脱除fmoc保护基后与其他fmoc-氨基酸相继缩合得到带保护的shs-芋螺毒素线性肽，其中，cys3、cys15以trt基团保护，cys4以acm基团保护，以及cys10以mebzl基团保护；裂解该带保护的shs-芋螺毒素线性肽，并依次脱除cys的保护基trt、acm和mebzl，每次脱除保护基后进行氧化反应以制备芋螺毒素。该方法过程比较繁琐，且不适合大规模生产。
技术实现思路
1、本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，提供了一种成本低、操作简便、反应条件温和、有利于实现产业化的新型的芋螺肽制备方法。
2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
3、一种芋螺肽的规模化制备方法，包括：采用固相合成法制备芋螺肽树脂，对芋螺肽树脂进行裂解处理得到芋螺肽线肽粗肽，对芋螺肽线肽粗肽进行环化以及纯化分离，得到芋螺肽；固相合成法中采用偶联剂将氨基酸试剂偶联到氨基树脂上；
4、偶联剂包括dic和化合物a的组合物，或，偶联剂包括碱与化合物a和化合物b的组合物；
5、化合物a为oxyma、吡啶杂环化合物、hobt和hoat中的至少一种，吡啶杂环化合物中具有吡啶基团和n杂环基团；其中，当吡啶杂环化合物作为化合物a参与芋螺肽的制备时，芋螺肽的产量提高至4.43g，芋螺肽的收率提升至31.26%。oxyma作为一种新型偶联剂，其在反应中生成的芋螺肽肽树脂具有较高的反应性，这使得其在多肽合成中表现出优异效果，本发明将oxyma替换成吡啶杂环化合物芋螺肽的产量和收率效果均得到明显提升。
6、化合物b为dic、pybop、pyaop、hatu、hbtu和tbtu中的至少一种，碱为dipea、tea、2,4,6-tmp和nmm中的至少一种。
7、优选地，偶联剂为dic和吡啶杂环化合物；或，偶联剂为dic和吡啶杂环化合物、碱。
8、优选地，吡啶杂环化合物的制备中，首先由3-氨基吡啶-2-甲酸与苄氧胺盐酸盐反应生成中间体1，然后由中间体1与乙醛反应生成中间体2；最后催化氢化脱去苄氧胺，得到吡啶杂环化合物。
9、更优选地，3-氨基吡啶-2-甲酸与苄氧胺盐酸盐在含有tea和edci的dcm中反应，tea的用量为0.5~2摩尔份，edci的用量为0.05~1摩尔份，dcm用量为2~8摩尔份。
10、更优选地，中间体1与乙醛在乙酸中反应，乙醛的用量为0.5~2摩尔份，乙酸的用量为0.5~2摩尔份。
11、优选地，化合物a的用量为10~70摩尔份；或，化合物b的用量为50~70摩尔份；或，碱的用量为50~120摩尔份，氨基树脂上的取代度为0.4~0.8mmol/g。
12、优选地，氨基树脂为am resin或mbha resin。
13、优选地，裂解处理中采用裂解液，裂解液由tfa、edt和tis组成，裂解液中tfa、edt和tis的体积比为80~90:5~10:5~10。
14、优选地，芋螺肽线肽粗肽的制备中，采用异丙醚进行沉降。
15、优选地，芋螺肽线肽粗肽的环化处理中采用含有半胱氨酸盐酸盐的缓冲溶液，缓冲溶液中含有半胱氨酸盐酸盐、dmso和水，半胱氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1~5mmol/l，dmso的体积百分比浓度为5~25%。
16、本发明的制备方法，通过氨基树脂采用逐一偶联的方式偶联fmoc保护基团的其他氨基酸，获得芋螺肽肽树脂。芋螺肽肽树脂经裂解反应，获得芋螺肽线肽粗肽。对芋螺肽线肽粗肽中的三个二硫键进行环化，并在hplc下经纯化、冻干等步骤，获得芋螺肽。不仅有效提高了芋螺肽的收率，而且方法简单，能够实现芋螺肽的大规模生产。
17、优选地，芋螺肽的制备方法，具体为：
18、取芋螺肽线肽粗肽，用缓冲溶液溶解并稀释，用氨水调ph，进行氧化折叠反应，hplc监控反应终点，经纯化和冻干，获得芋螺肽。
19、优选地，芋螺肽的制备方法中，芋螺肽线肽粗肽的质量为100~200重量份。
20、优选地，芋螺肽的制备方法中，半胱氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1~5mmol/l。
21、优选地，芋螺肽的制备方法中，dmso的体积百分比浓度为5~25%。
22、优选地，芋螺肽的制备方法中，将芋螺肽线肽粗肽溶解并稀释至1.0~5.0mg/ml。
23、优选地，芋螺肽的制备方法中，ph为7.5~9.0。
24、优选地，芋螺肽线肽粗肽的制备方法，具体为：
25、取芋螺肽肽树脂，加入tfa、edt和tis三者混合的裂解液淹没芋螺肽肽树脂，搅拌均匀，在一定温度下反应，反应后的混合物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，滤饼再用tfa洗涤，合并滤液，将滤液加入到异丙醚中沉降，再用异丙醚洗涤，真空减压干燥至恒重，得到芋螺肽线肽粗肽。
26、优选地，芋螺肽线肽粗肽的制备方法中，裂解液中各组分的体积百分含量为tfa:85～95%；tis:3～8%；edt:3～8%。
27、优选地，芋螺肽线肽粗肽的制备方法中，裂解液的用量为6~10ml/g。
28、优选地，芋螺肽线肽粗肽的制备方法中，裂解液中tfa、edt和tis的体积比为80~90:5~10:5~10。
29、优选地，芋螺肽线肽粗肽的制备方法中，反应温度为20~25℃，反应时间为2.0~4.0h。
30、优选地，芋螺肽线肽粗肽的制备方法中，用于沉降的异丙醚的温度为-10~0℃。
31、更优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法，具体为：
32、投入树脂溶胀，在fmoc脱保护剂下反应脱去fmoc保护基，溶剂洗涤树脂，投入活化的氨基酸，在偶联体系作用下于偶联溶剂中从羧基端到氨基端依次按照肽序连接氨基酸进行偶联，反应结束进行树脂洗涤干燥，得到二十二肽氨基树脂。具体地，根据芋螺肽的序列，依次投入fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh反应，直至所有氨基酸连接完成，用dcm、甲醇收缩树脂，晾干，得到芋螺肽肽树脂。
33、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，氨基树脂为am resin、mbha resin或其他同等功能树脂。
34、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，氨基树脂的用量为20~50质量份。
35、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，氨基树脂的取代度为0.4~0.8mmol/g。
36、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，溶胀中使用dmf，用量为120~300体积份，氨基树脂和dmf的使用量关系为50g：250ml。
37、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，洗涤中使用dmf，用量为120~300体积份。
38、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ser (tbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh的使用量为50~70摩尔份，fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ser (tbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、boc-pyr-oh和dmf的使用量关系为60mmol：250ml。
39、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，偶联剂为dic和化合物a的组合物。其中化合物a为oxyma、吡啶杂环化合物、水杨羟肟酸、hobt或hoat。其中，当水杨羟肟酸参与芋螺肽的制备时，芋螺肽的产量及收率明显提升。这主要归因于水杨羟肟酸作为中间体参与缩合反应，同时由于其本身存在羟基和肟基官能团，其能够与其他官能团相互作用，从而促进酯化反应，进而有利于芋螺肽肽树脂的制备，从而使得芋螺肽的产量和收率均得到显著提升。
40、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，偶联剂为碱与化合物a和化合物b的组合物，其中化合物a为oxyma、吡啶杂环化合物、水杨羟肟酸、hobt或hoat，化合物b为dic、pybop、pyaop、hatu、hbtu或tbtu。
41、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，碱为dipea、tea、2,4,6-tmp、nmm中的至少一种。
42、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，化合物a的用量为10~70摩尔份。
43、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，化合物b的用量为50~70摩尔份。
44、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，碱的用量为50~120摩尔份。
45、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，偶联温度为20~35℃，反应时间为90~120min。
46、优选地，芋螺肽肽树脂的制备方法中，收缩中dcm的用量为50~350体份积，收缩中甲醇的用量为50~350体份积。
47、更优选地，吡啶杂环化合物的制备方法，具体为：
48、将3-氨基吡啶-2-甲酸溶解在dcm中，加入tea和edci，常温搅拌加入苄氧胺盐酸盐，过夜，使用tlc监测。反应完全用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂过柱得到中间体1。接着加入乙醛和乙酸后在一定温度下反应过夜至完全反应，tlc监测，将体系旋干得到中间体2。将中间体溶解在甲醇中后加入pd/c，接上氢气袋后于一定温度下加热反应过夜，用tlc检测反应。过滤，旋干溶剂后过柱，得到吡啶杂环化合物。
49、优选地，吡啶杂环化合物的制备方法中，3-氨基吡啶-2-甲酸的用量为0.5~2摩尔份。
50、优选地，吡啶杂环化合物的制备方法中，dcm用量为2~8摩尔份。
51、优选地，吡啶杂环化合物的制备方法中，tea的用量为0.5~2摩尔份。
52、优选地，吡啶杂环化合物的制备方法中，edci的用量为0.05~1摩尔份。
53、优选地，吡啶杂环化合物的制备方法中，乙醛的用量为0.5~2摩尔份。
54、优选地，吡啶杂环化合物的制备方法中，乙酸的用量为0.5~2摩尔份。
55、过柱体系中pe和ea混合作为洗脱剂进行柱层析分离时，过柱体系中ea和pe二者的的体积比是逐渐变化的，体积比为1：2~50。
56、优选地，吡啶杂环化合物的制备方法中，反应温度40~60℃。
57、本发明由于采用了逐一偶联的方式偶联fmoc保护基团的其他氨基酸制得芋螺肽肽树脂，进而通过环化、纯化及冻干等步骤制得芋螺肽，因而具有如下有益效果：本发明的芋螺肽具有较低的成本、较为简便的操作步骤、比较温和的反应条件同时有利于芋螺肽实现产业化。因此，本发明是一种成本低、操作简便、反应条件温和、有利于实现产业化的新型的芋螺肽制备方法。
1.一种芋螺肽的规模化制备方法，包括：采用固相合成法制备芋螺肽树脂，对芋螺肽树脂进行裂解处理得到芋螺肽线肽粗肽，对芋螺肽线肽粗肽进行环化以及纯化分离，得到芋螺肽；所述固相合成法中采用偶联剂将氨基酸试剂偶联到氨基树脂上；
2.根据权利要求1所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述偶联剂为dic和吡啶杂环化合物；或，所述偶联剂为dic和吡啶杂环化合物、碱。
3.根据权利要求1所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述吡啶杂环化合物的制备中，首先由3-氨基吡啶-2-甲酸与苄氧胺盐酸盐反应生成中间体1，然后由中间体1与乙醛反应生成中间体2；最后催化氢化脱去苄氧胺，得到吡啶杂环化合物。
4.根据权利要求3所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述3-氨基吡啶-2-甲酸与苄氧胺盐酸盐在含有tea和edci的dcm中反应，tea的用量为0.5~2摩尔份，edci的用量为0.05~1摩尔份，dcm用量为2~8摩尔份。
5.根据权利要求3所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述中间体1与乙醛在乙酸中反应，乙醛的用量为0.5~2摩尔份，乙酸的用量为0.5~2摩尔份。
6.根据权利要求1所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述化合物a的用量为10~70摩尔份；或，化合物b的用量为50~70摩尔份；或，碱的用量为50~120摩尔份，氨基树脂上的取代度为0.4~0.8mmol/g。
7. 根据权利要求1所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述氨基树脂为 am resin或mbha resin。
8.根据权利要求1所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述裂解处理中采用裂解液，裂解液由tfa、edt和tis组成，裂解液中tfa、edt和tis的体积比为80~90:5~10:5~10。
9.根据权利要求1所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述芋螺肽线肽粗肽的制备中，采用异丙醚进行沉降。
10.根据权利要求1所述的一种芋螺肽的规模化制备方法，其特征在于，所述芋螺肽线肽粗肽的环化处理中采用含有半胱氨酸盐酸盐的缓冲溶液，缓冲溶液中含有半胱氨酸盐酸盐、dmso和水，半胱氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1~5mmol/l，dmso的体积百分比浓度为5~25%。
