发明领域本技术涉及靶向egfr和lag3的双特异性抗体，以及此类抗体的用途，特别是它们在癌症治疗中的用途。
背景技术：
1、表皮生长因子受体(egfr)是由c-erbb1原癌基因编码的170kda的跨膜糖蛋白。它由具有激酶活性的c端胞内区、n端胞外受体结合位点和疏水跨膜结构域组成。egfr是酪氨酸激酶(rtk)的受体。rtk在控制细胞循环、细胞迁移、细胞代谢和生存以及细胞增殖和分化等最基本的细胞过程中起到重要作用。经由酪氨酸激酶调节的信号转导通路，egfr可以调节大量细胞过程。此外，egfr的激活导致多个信号传导级联同时激活，包括mapk通路、蛋白激酶c(pkc)通路和pi(3)k激活的akt通路。
2、egfr在人肿瘤中经常过表达或突变，并且有助于人肿瘤生长。约30％的实体瘤显示出egfr的功能获得性基因改变，包括膀胱、脑、头颈、胰腺、肺、乳腺、卵巢、结肠、前列腺和肾的癌症。一些细胞展示出“原癌基因成瘾”，一个由weinstein在2002年引入的概念，因为它们依赖于egfr信号传导通路来生存和生长。因此，靶向egfr可能是一个具有很大成效的很好的治疗方法。已经报道了靶向egfr并阻断egfr信号传导通路的各种策略，包括西妥昔单抗和帕尼单抗。所有这些策略都确认靶向egfr是有效的抗肿瘤疗法。
3、淋巴细胞活化基因-3(lag3或cd223)最初是在一项设计用来选择性分离在il-2依赖的nk细胞系中表达的分子的实验中发现的。它是一种与cd4具有结构同源性的且具有四个胞外糖基化位点的70kda的跨膜蛋白。lag3在静息外周血淋巴细胞中不表达，但是在激活的t细胞、nk细胞、一些b细胞和dc细胞中表达。与cd4一样，lag3蛋白以较高亲和力与mhc ii类分子结合。但与cd4不一样的是，lag3不与人免疫缺陷病毒gp120蛋白相互作用。使用可溶性lag3免疫球蛋白融合蛋白(slag3ig)进行的研究表明lag3与细胞表面的mhc ii类分子直接且特异性的结合。
4、lag3的细胞质尾由三个保守基序组成，其中一个基序是高度独特并保守的六个氨基酸序列(kieele,seq id no:20)，已显示其是lag3下调t细胞功能所必需的。lag3与其配体(表达在抗原呈递细胞，如巨噬细胞和dc细胞上的mhc ii类分子)的相互作用，抑制t细胞和nk细胞的活化，抑制t细胞和nk细胞识别并杀伤癌症细胞的能力。此外，已显示cd4+cd25+调节t细胞(treg)在活化后表达lag3，并且针对lag3的抗体在体外和体内均抑制由经诱导的treg细胞引起的抑制，表明lag3有助于treg细胞的抑制子活性。
5、egfr和lag3在癌症中各自的作用已得到充分证实，而靶向egfr或lag3的单一疗法最初在癌症治疗中可能是高效的，但耐药性往往随之而来。因此，存在对egfr×lag3双靶向的双特异性抗体的需要，该抗体预测通过同时识别两种抗原来实现有效地癌症治疗。
技术实现思路
0、发明概述
1、本公开提供了设计用于同时与靶细胞上的表面抗原和某些免疫细胞，例如t细胞结合的egfr×lag3重组双特异性抗体。大量功能测定已经表明以egfr×lag3双特异性抗体形式工程化的抗体在多种癌症(尤其是egfr阳性癌症，例如结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌)上的强有力的抗肿瘤效果。
2、在一个方面，本公开提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与egfr结合的第一抗原结合区，该第一抗原结合区包含第一轻链可变区(vl1)和第一重链可变区(vh1)，和与lag3结合的第二抗原结合区，该第二抗原结合区包含第二轻链可变区(vl2)和第二重链可变区(vh2)，其中vl1包含分别具有如seq id no:1-3所示的氨基酸序列的lcdr1-3；该vh1包含分别具有如seq id no:5-7所示的氨基酸序列的hcdr1-3；该vl2包含分别具有如seq id no:9-11所示的氨基酸序列的lcdr1-3；并且该vh2包含分别具有如seq id no:13-15所示的氨基酸序列的hcdr1-3。
3、在一些本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的实施方式中，vl1包含与seqid no:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；vh1包含与seq id no:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；vl2包含与seq id no:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且vh2包含与seq id no:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
4、在一些实施方式中，vl1包含如seq id no:4所示的氨基酸序列；vh1包含如seq idno:8所示的氨基酸序列；vl2包含如seq id no:12所示的氨基酸序列；并且vh2包含如seqid no:16所示的氨基酸序列。
5、在一些实施方式中，该双特异性抗体包含：第一多肽链，其从n端至c端包含：vh2-ch1-ch2-ch3-l1-vh1-l2-vl1；和第二多肽链，其从n端至c端包含：vl2-cl；其中ch1表示免疫球蛋白重链的恒定区的第一结构域；ch2表示免疫球蛋白重链的恒定区的第二结构域；ch3表示免疫球蛋白重链的恒定区的第三结构域；cl表示免疫球蛋白轻链的恒定区；且l1和l2各自独立地表示任选的接头。
6、在一些实施方式中，该双特异性抗体包含第一多肽链的两个拷贝和第二多肽链的两个拷贝。
7、在一些实施方式中，ch1、ch2和ch3中的每一个独立地衍生自免疫球蛋白同种型igg(例如，人igg)，优选地衍生自选自igg1、igg2和igg4(例如，人igg1、igg2和igg4)的igg亚型。
8、在一些实施方式中，cl衍生自λ轻链或κ轻链。
9、在一些实施方式中，接头包含(g4s)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数，优选地该接头包含如seq id no:19所示的氨基酸序列。
10、在一些实施方式中，第一多肽链包含与seq id no:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且第二多肽链包含与seq id no:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
11、在一些实施方式中，第一多肽链包含如seq id no:17所示的氨基酸序列；并且该第二多肽链包含如seq id no:18所示的氨基酸序列。
12、在另一个方面，本公开提供了核酸，其包含编码本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
13、在又一方面，本公开提供了载体，其包含本文公开的核酸。
14、在又一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含本文公开的核酸或本文公开的载体。
15、在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。
16、在本文公开的药物组合物的一些实施方式中，该药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂、vegf抑制剂和糖皮质激素。
17、在另一方面，本公开提供了缀合物，其包含本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。
18、在本文公开的缀合物的一些实施方式中，该化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。
19、在又一方面，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法,包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物。
20、在本文公开的方法的一些实施方式中，该癌症是egfr阳性癌症。在一些实施方式中，该癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌。在优选的实施方式中，该癌症选自结直肠癌、头颈癌、肾癌和皮肤癌。
21、在一些实施方式中，该方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂、vegf抑制剂和糖皮质激素。
22、在另一方面，本公开提供本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
23、在又一方面，本公开提供本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物用于治疗受试者的癌症。
24、在本文公开的用途的一些实施方式中，该癌症是egfr阳性癌症。在一些实施方式中，该癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌。在优选的实施方式中，该癌症选自结直肠癌、头颈癌、肾癌和皮肤癌。
25、在一些实施方式中，本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的缀合物与第二治疗剂联合。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。在一些实施方式中，该第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂、vegf抑制剂和糖皮质激素。
1.双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含与egfr结合的第一抗原结合区和与lag3结合的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一轻链可变区(vl1)和第一重链可变区(vh1)，所述第二抗原结合区包含第二轻链可变区(vl2)和第二重链可变区(vh2)，其中
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗体结合片段，其中
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体或其抗体结合片段，其中
4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体包含：
5.根据权利要求4所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体包含所述第一多肽链的两个拷贝和所述第二多肽链的两个拷贝。
6.根据权利要求4或5所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述ch1、ch2和ch3中的每一个独立地衍生自免疫球蛋白同种型igg(例如，人igg)，优选地衍生自选自igg1、igg2和igg4(例如，人igg1、igg2和igg4)的igg亚型。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述cl衍生自λ轻链或κ轻链。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述接头包含(g4s)n的氨基酸序列，其中n是选自1-5的整数，优选地所述接头包含如seq id no:19所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中
11.核酸，其包含编码根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
12.载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。
13.宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸或根据权利要求12所述的载体。
14.药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其进一步包含第二治疗剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。
17.根据权利要求15或16所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂、vegf抑制剂和糖皮质激素。
18.缀合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，以及与其缀合的化学部分。
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述化学部分选自治疗剂、可检测部分和免疫刺激分子。
20.治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求14-17中任一项所述的药物组合物或根据权利要求18或19所述的缀合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述癌症是egfr阳性癌症。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、肾癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、脑癌、膀胱癌和肝癌，优选结直肠癌、头颈癌、肾癌或皮肤癌。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂、pi3k抑制剂、hdac抑制剂、erk抑制剂、mapk抑制剂、pd-1/pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tigit抑制剂、tim3抑制剂、vegf抑制剂和糖皮质激素。
