本发明涉及用于制备基于体外进化的热点来源肽-核酸杂交分子的方法。本技术要求于2022年4月27日提交的韩国专利申请号10-2022-0052389以及于2023年4月5日提交的韩国专利申请号10-2023-0044921的权益和优先权，其公开内容以其全部内容通过援引并入本文。
背景技术：
1、为了感染宿主细胞，许多病毒在它们进入宿主细胞时特异性识别细胞膜蛋白。例如，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)被数千个刺突蛋白覆盖，与人血管紧张素转换酶2(hace2)即膜受体强烈结合，导致膜融合。为了获得更高的感染性，包括sars-cov-2的病毒经常会发生突变，从而增强病毒的传染性并随着时间的推移引起免疫逃逸。自2019年首次报告sars-cov-2以来，出现了许多变体，包括α(b.1.1.7)、β(b.1.351)、γ(p.1)、δ(b.1.617.2)和ο(b.1.1.529)的值得关注变体(voc)已独立发生在不同的大陆。有助于特异性hace2识别的刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)，已知包含许多常见突变。特别是，位于结合热点的一些突变(例如n501y)已被确定可增加rbd与靶hace2的结合亲和力，从而增加sars-cov-2的传染性。
2、变体的频繁出现可能是开发抗病毒预防和治疗策略的主要障碍。为了避免病毒感染，使用亲和试剂可以是阻断病毒与宿主细胞之间的特异性相互作用的有效方法。对于sars-cov-2，已经开发了许多中和亲和试剂来识别刺突蛋白的各种表位，已知其中一些表位与hace2接触表面部分重叠。然而，由于一些逃逸突变会引起刺突蛋白的结构变化，因此亲和试剂不可避免地会失去对其结合位点的特异性识别，从而导致中和功效降低。作为替代方案，可以共同给药非竞争性亲和试剂，并且由于sars-cov-2变体的迅速出现，美国食品和药物管理局(fda)已发布抗体混合物诸如regn-cov2的紧急使用授权。随着病毒变体积累逃逸突变，它们往往对抗体混合物产生更强的抗性，同时与宿主细胞受体产生更强的结合相互作用。因此，有必要开发对靶病毒具有高亲和力的有效且高效的中和剂，同时考虑到对其变体的结合耐受性。
技术实现思路
1、[技术问题]
2、受到病毒变体的受体识别改进的启发，本发明人发明了能够与靶病毒及其变体有效相互作用的受体模拟合成试剂的生成。具体来说，他们关注宿主细胞受体上的肽基序，该肽基序对病毒-受体界面中心的结合自由能具有显著贡献。在没有稳定但不溶性的跨膜结构域的情况下，短热点肽则无法保持与靶病毒的最佳结合能力。在此过程中，它与可充当结合协同剂以及结构稳定剂的可溶性核酸协同整合。从众多热点肽偶联的随机核酸(～1014)中，通过选择性分离和扩增适配体样支架，可以轻松发现杂交配体，从而使热点相互作用最大化，其可导致与病毒变体的强结合。
3、另外，发明人通过使用一种名为“热点导向配体展示”(hold)的新型体外进化技术，成功创建了一种hace2受体模拟杂交配体，其直接与sars-cov-2的热点相互作用。与报告的亲和试剂(例如肽、适配体或中和抗体)相比，热点肽和适配体支架之间的协同相互作用通过更有效地与rbd结合，来实现了对sars-cov-2的有效阻断。此外，在识别各种sars-cov-2变体(例如α、β、γ、δ和ο)时，发明人证实，热点结合hace2模拟物保持或甚至增强了其对sars-cov-2变体的结合能力，并完成了本发明。
4、因此，本发明的一个目的是提供了一种制备靶蛋白结合肽-核酸杂交分子的方法，包括以下步骤：
5、(a)将热点来源肽与随机核酸文库进行位点特异性缀合以制备肽-核酸杂交体；
6、(b)将所述靶蛋白包被的磁性珠粒与步骤(a)的所述肽-核酸杂交体共温育；以及
7、(c)使用磁体筛选与靶蛋白结合的肽-核酸杂交分子。
8、本发明的另一目的是提供了一种通过本发明的方法来制备的肽-核酸杂交分子。
9、本发明的另一目的是提供一种用于中和病毒的组合物，包括通过本发明的方法来制备的肽-核酸杂交分子。
10、本发明的另一目的是提供一种抑制或中和病毒的方法，包括向有此需要的个体给药通过本发明的方法制备的肽-核酸杂交分子。
11、然而，本发明的技术挑战不限于上面提及的那些，并且鉴于以下描述，对于本领域普通技术人员来说未提及的其他挑战是显而易见的。
12、[技术方案]
13、本说明书中使用的术语仅用于说明目的并且不应被解释为限制本发明。除非上下文另有明确指示，否则单数表达包括复数表达。在本说明书中，术语“包括”或“具有”等表示特征、数字、步骤、动作、组分、部分或其组合的存在，并且不排除存在或添加一个或多个其他特征、数字、步骤、动作、组分、部分或其组合。
14、除非另有定义，否则本文使用的所有术语，包括技术或科学术语，具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非在本技术中明确定义，否则术语诸如常用词典中定义的那些术语应被解释为具有与其在相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的含义进行解释。
15、以下，对本发明进行详细说明。
16、本发明提供了一种制备靶蛋白结合肽-核酸杂交分子的方法，包括以下步骤：
17、(a)将热点来源肽与随机核酸文库进行位点特异性缀合以制备肽-核酸杂交体；
18、(b)将所述靶蛋白包被的磁性珠粒与步骤(a)的所述肽-核酸杂交体共温育；以及
19、(c)使用磁体筛选与靶蛋白结合的肽-核酸杂交分子。
20、在本发明中，该方法可以称为热点导向配体展示(hold)，其是指制备基于体外进化的热点来源肽-核酸杂交分子的方法。hold可以确保通过该方法制备的肽-核酸杂交分子由于热点肽和适配体支架之间的协同作用而对rbd具有强的结合亲和力，并且尤其可以确保肽-核酸杂交分子即使在rbd突变时也保持稳健的结合。
21、换言之，通过上述方法产生的肽-核酸杂交分子是通过使用基于体外进化技术随机合成的许多核酸文库而被选择为能够最强结合至病毒的rbd位点而非受体的分子。
22、在本发明中，制造方法的特征可以进一步包括以下步骤，但不限于此：
23、(d)选择性扩增并克隆步骤(c)中选择的肽-核酸杂交分子的核酸部分；
24、(e)通过使用外切核酸酶将步骤(d)中生成的双链dna制备成单链dna，并将其纯化；以及
25、(f)制备包括步骤(e)的所述单链dna的新的随机核酸文库，并重复步骤(a)至(f)的选择、扩增和纯化过程。
26、在本发明中，该方法可以进一步包括，在步骤(a)之后，热变性和冷却肽-核酸杂交体以诱导核酸的3d折叠。此步骤允许热点肽定位在正确的位置和方向，并且可以制备稳定的3d适配体支架，其可以保持与受体相比相似或更强的结合特性。
27、步骤(d)的核酸部分的选择性扩增可使用与附接至5’端的一种或多种官能团缀合的正向引物进行扩增，该官能团选自由以下组成的组但不限于以下：己炔基、5-辛二炔基和炔烃。因为官能团结合到正向引物，扩增的任何pcr产物都可以用附接至5'端的官能团产生，这允许通过点击反应进行位点特异性缀合，但不限于此。
28、在本发明中，热点来源肽是被认为与受体和其靶蛋白之间的结合高度相关的肽残基。由于本发明的hold方法不限于热点来源肽，而是普遍适用的，因此所使用的热点来源肽的类型不受限制。因此，本领域已知或将要已知的影响受体和其靶蛋白之间结合的多种肽位点可以用作热点肽。热点来源肽的一种优选实施方式是hace2来源的热点肽，或hace2来源的rbd结合肽，但不限于此。
29、热点来源肽可以是靶蛋白与其受体之间结合位点处的氨基酸；靶蛋白序列中该结合位点所涉及的全部或部分氨基酸；或者受体序列中该结合位点涉及的全部或部分氨基酸。
30、热点来源肽可以是具有可在点击化学反应中使用的任何官能团的肽，该官能团结合到分离的热点来源肽的c末端或n末端，并且它可以是例如与选自由叠氮赖氨酸、叠氮丁酸、叠氮乙酸、叠氮化物、己炔基、5-辛二炔基和炔烃组成的组的至少一种官能团缀合的肽，优选在c末端或n末端与叠氮化物缀合(标记)的肽，更优选叠氮化物标记的lgkgdfr(l351至r357，具有seq id no:15)肽，但不限于此。
31、在本发明中，靶蛋白可以是以下，但不限于以下：病毒包膜蛋白、生长因子蛋白、细胞膜受体、抗体、抗原蛋白、用于将病毒与宿主细胞的受体结合的蛋白位点，或包含受体结合结构域(rbd)位点的蛋白。
32、在本发明中，包膜蛋白可以选自由以下组成的组，但不限于以下：刺突蛋白、纤维蛋白和包膜糖蛋白。
33、在本发明中，生长因子蛋白可以是表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子或骨形态发生蛋白质。
34、在本发明中，细胞膜受体可以是病毒蛋白和生长因子蛋白结合的任何受体，并且可以是存在于细胞膜上的独立受体，诸如pd-1和pd-l1，但不限于此。
35、在本发明的一种实施方式中，热点肽-核酸杂交分子可制备用于开发冠状病毒治疗剂，其中热点来源肽是受体hace2的rbd接触残基的l351至r357(lgkgdfr，seq id no.15)的七个氨基酸片段。靶蛋白可以是刺突蛋白，优选但不限于刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)。因此，制备的热点肽-核酸杂交分子可以抑制sars-cov-2的rbd与hace2受体之间的相互作用。
36、在本发明中，适配体支架是与肽连接的核酸，有助于该肽的功能，并且能够与特定分子强烈且特异性结合的核酸。在本发明的一种实施方式中，也称为基于肽的适配体支架，其与热点来源肽组合以具有病毒中和功能，并且该肽和适配体支架的杂交分子可以与靶蛋白结合。
37、在本发明中，随机化核酸文库可以是结合了可在5’端点击化学反应中使用的任何官能团的核酸，例如包括具有选自由以下组成的组但不限于以下的一种或多种官能团的单链核酸的核酸：己炔基、5-辛二炔基、炔烃、叠氮赖氨酸、叠氮丁酸、叠氮乙酸和叠氮化物，优选核酸是在5’端结合有己炔基基团的核酸。此外，与热点来源肽和核酸文库结合的官能团可以互换。
38、而且，随机核酸文库的特征可以是包括具有如下所示结构的随机核酸：
39、5'-官能团-正向引物-[nx]-反向引物-3'，
40、其中，所述官能团选自由己炔基、5-辛二炔基、炔烃、叠氮赖氨酸、叠氮丁酸、叠氮乙酸和叠氮化物组成的组，
41、其中，n为a、t、c或g，并且x为25至100的整数。
42、随机核酸文库的长度被最小化以精确结合具有直径为10nm或更小的靶蛋白，并且可以是适合于最大化文库多样性的任何长度，但具体而言，随机核酸文库中的序列数目可以是但不限于55至130、55至110、55至90、55至80、60至130、60至110、60至90、60至80、65至130、65至110、65至90、65至80、65至75或70。
43、此外，x可以是但不限于25至100、25至80、25至60、25至50、30至100、30至80、30至60、30至50、35至100、35至80、35至60、35至50、35至45或40。
44、本发明的优选实施方式利用seq id no.1所示的正向引物和seq idno.2所示的反向引物，其中，随机化核酸文库包括结构式ggaagagatggcgac-n40-agctgatcctgatgg的随机化核酸。
45、在本发明中，热点来源肽和单链核酸的特征可以是但不限于通过点击反应进行位点特异性偶联。点击反应可以是以下但不限于以下的反应，其中，热点来源肽的官能团和核酸的官能团在短时间内彼此化学交联或通过铜催化的环加成键合。
46、在本发明中，靶蛋白可以是以下，但不限于以下：病毒包膜蛋白、生长因子蛋白、细胞膜受体、抗体或抗原蛋白。病毒包膜蛋白可以选自由以下组成的组，但不限于以下：刺突蛋白、纤维蛋白和包膜糖蛋白。
47、在本发明中，病毒可选自由以下组成的组，但不限于以下：冠状病毒、流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒、疱疹病毒、埃博拉病毒、mers病毒、轮状病毒、汉坦病毒、猴痘病毒、腺病毒、狂犬病毒和诺如病毒。
48、在本发明中，冠状病毒可以是选自由以下组成的组的一种，但不限于以下：人冠状病毒229e(hcov-229e)、人冠状病毒oc43(hcov-oc43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、人冠状病毒nl63(hcov-nl63，纽黑文冠状病毒)、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)及其变体，其中，sars-cov-2变体可以是选自由以下组成的组的任何一种，但不限于以下：alpha(α)、beta(β)、gamma(γ)、delta(δ)和omicron(ο)变体。
49、在本发明中，“冠状病毒”是包括在套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒亚科或环曲病毒亚科中的病毒属物种。冠状病毒是由+ssrna和螺旋对称核肽包膜的病毒。另外，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是迄今为止感染人的第七种冠状病毒，并且其他是人冠状病毒229e(hcov-229e)、人冠状病毒oc43(hcov-oc43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、人冠状病毒nl63(hcov-nl63，纽黑文冠状病毒)、人冠状病毒hku1和中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)。构成冠状病毒整体结构的蛋白是刺突、包膜和核衣壳。就sars冠状病毒而言，刺突(s)上已建立的配体受体结构域介导病毒与其细胞受体即血管紧张素转换酶2(ace2)的附着。一些冠状病毒(尤其是β冠状病毒亚群)也有一种称为反义酯酶的蛋白的短刺突。冠状病毒可引起病毒性肺炎或继发细菌性肺炎，并且其也可引起直接病毒性支气管炎或继发性细菌性支气管炎。2003年发现的人冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)，它会引起严重急性呼吸综合征(sars)即一种上呼吸道和下呼吸道感染。
50、此外，如本文所用，术语“sars-cov-2”是指新的冠状病毒，其是rna病毒，是sars和mers的变体。sars-cov-2与sars具有约79.7％的序列同一性，与mers具有约50％的序列同一性。然而，与sars和mers相比，2019-ncov的刺突糖蛋白形成一种具有向上突出的rbd结构域的结构，导致与其靶受体ace2(血管紧张素)的结合强度是sars和mers的100至1,000倍。这种更强的结合可以更好地渗透到细胞中，从而增强感染性。
51、此外，出于本发明的目的，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的变体表示covid-19的变体。变体分为主要变体[关注变体(voc)]和其他变体[感兴趣变体(voi)]，并且变体以希腊字母(α、β、γ等)命名，以防止被利用本地化名称并促进沟通。主要变体是以下的那些变体：已被确定为具有传播增加或流行病学负面变化、致病性增加或疾病严重程度发生临床显著变化、或者诊断、疫苗、治疗等有效性降低的变体。目前，voc是ο变体，并且在过去，它们包括α、β、γ和δ变体。具体而言，sars-cov-2的alpha(α)变体于2020年9月在英国被鉴定出，并且具有的系谱分类为b.1.1.7。另外，sars-cov-2的beta(β)变体于2020年5月在南非被鉴定出，并且具有的系谱分类为b.1.351。此外，sars-cov-2的gamma(γ)变体于2020年11月在巴西被鉴定出，并且具有的系谱分类为p.1。此外，sars-cov-2的delta(δ)变体于2020年10月在印度被鉴定出，并且具有的系谱分类为b.1.617.2。另外，sars-cov-2的omicron(o)变体于2021年11月在多个国家被鉴定出，并且具有的系谱分类为b.1.1.529。
52、在本发明中，肽-核酸杂交分子可以满足以下特征的任何一种，但不限于以下：(a)核酸酶抗性；和(b)血清稳定性。另外，它可以中和病毒并在靶蛋白的rbd之间提供静电相互作用，但不限于此。
53、此外，肽-核酸杂交分子可以根据治疗目的和配制方法通过各种给药途径给药，优选地，通过静脉内给药，但不限于此。此外，肽-核酸杂交分子可以是以下，但不限于以下：杂交配体、热点肽结合的适配体支架、受体模拟杂交配体或hace2模拟杂交配体。
54、在本发明中，在肽-核酸杂交分子中，核酸在点击反应中与热点来源肽偶联并用于制备肽-核酸杂交分子。此外，可以通过重复的选择和扩增循环，在体外从与热点肽进行位点特异性连接的许多其他核酸的文库中分离核酸，其中可以选择能够提供与肽-核酸杂交分子更高结合的核酸。而且，该核酸可以增加肽-核酸杂交分子与刺突蛋白和其受体之间的结合位点(rbd)的结合亲和力，并且例如可以在结构上稳定hace2来源的rbd结合肽。此外，核酸可以是但不限于己炔基修饰的ssdna、适配体支架或基于热点肽的适配体支架。
55、在本发明中，肽-核酸杂交分子即使与rbd结合亲和试剂竞争，也能呈现出与rbd的优异结合，并且即使当靶蛋白的结合位点(rbd)突变时，也能呈现出优异的结合。具体而言，肽-核酸杂交分子可以呈现出与sars-cov-2的关注变体(voc)的rbd的强结合，从而中和sars-cov-2，但不限于此。
56、在本发明中，rbd结合亲和试剂可以是以下，但不限于以下：rbd结合核酸适配体、大环肽或单克隆抗体。此外，sars-cov-2的voc可以是以下，但不限于以下：alpha(α)、beta(β)、gamma(γ)、delta(δ)或omicron(ο)变体。
57、本发明提供了一种通过本发明的方法来制备的肽-核酸杂交分子。肽-核酸杂交分子可以阻断病毒与宿主细胞受体的结合，但不限于此。
58、本发明还提供了一种用于中和病毒的组合物，包括通过本发明的方法来制备的肽-核酸杂交分子。
59、本发明还提供一种抑制或中和病毒的方法，包括向有此需要的个体给药通过本发明的方法制备的肽-核酸杂交分子。
60、[有益效果]
61、根据本发明的方法，可以快速制备和筛选热点来源的肽-核酸杂交分子，其能够以高亲和力与病毒结合并有效阻断病毒与受体之间的结合，以响应众多候选物中的各种病毒突变。因此，它可以非常有效地用于开发针对各种病毒突变的治疗剂。
1.一种制备靶蛋白结合肽-核酸杂交分子的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)之后，所述方法进一步包括热变性和冷却所述肽-核酸杂交体以诱导所述核酸的3d折叠的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，上述步骤(a)的所述热点来源肽是在c末端或n末端处具有选自由叠氮赖氨酸、叠氮丁酸、叠氮乙酸和叠氮化物组成的组的至少一种官能团的肽，
5.根据权利要求1所述的方法，其中，上述步骤(a)的所述热点来源肽是在c末端或n末端处具有选自由己炔基、5-辛二炔基和炔烃组成的组的至少一种官能团的肽，
6.根据权利要求2所述的方法，其中，上述步骤(d)的所述核酸部分的扩增利用具有选自由己炔基、5-辛二炔基和炔烃组成的组的一种或多种官能团的正向引物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述随机核酸文库具有以下结构：
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热点来源肽是受体及其靶蛋白之间的结合位点的氨基酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶蛋白是病毒包膜蛋白、生长因子蛋白、细胞膜受体、抗体或抗原蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述病毒包膜蛋白选自由刺突蛋白、纤维蛋白和包膜糖蛋白组成的组。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述病毒选自由以下组成的组：冠状病毒、流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒、疱疹病毒和埃博拉病毒、mers病毒、轮状病毒、汉坦病毒、猴痘病毒、腺病毒、狂犬病毒和诺如病毒。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述冠状病毒为选自由以下组成的组：人冠状病毒229e(hcov-229e)、人冠状病毒oc43(hcov-oc43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、人冠状病毒nl63(hcov-nl63，纽黑文冠状病毒)、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)及其变体。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽-核酸杂交分子结合受体与其靶蛋白之间的结合位点。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽-核酸杂交分子满足以下特征中的任一项：
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽-核酸杂交分子中和病毒。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸增强对所述肽-核酸杂交分子的受体与其靶蛋白之间的结合位点的结合亲和力。
17.一种肽-核酸杂交分子，其通过权利要求1至16中任一项所述的方法制备。
18.根据权利要求17所述的肽-核酸杂交分子，其中，所述肽-核酸杂交体分子用于阻断病毒与宿主细胞受体的结合。
19.一种用于中和病毒的组合物，包括通过权利要求1至16中任一项所述的方法制备的肽-核酸杂交分子。
20.一种抑制或中和病毒的方法，包括向有此需要的个体给药通过权利要求1至16中任一项所述的方法制备的肽-核酸杂交分子的步骤。
