本技术部分涉及检测口腔毛滴虫(trichomonas tenax)的方法和组合物。
背景技术：
1、口腔毛滴虫是栖息于口腔卫生差和牙周病患者的人和犬口腔中的鞭毛原生动物。此外，口腔毛滴虫与相关的人类寄生虫即阴道毛滴虫(t.vaginalis)一样，也在泌尿生殖道中检测到。然而，尽管口腔毛滴虫与牙周病和性传播疾病有关，但仍缺乏检测口腔毛滴虫的快速可靠的方法。因此，需要这种方法。
技术实现思路
0、发明概述
1、本公开部分涉及检测口腔毛滴虫的方法，包括制备用于检测的生物样品；对生物样品进行lamp；以及确定生物样品是否包含口腔毛滴虫。
2、在一些实施方案中，生物样品包括口腔拭子或唾液或尿液。
3、在一些实施方案中，在pbs中稀释生物样品。
4、在任一上述实施方案中，在进行lamp步骤之前，既没有对生物样品进行dna提取，也没有进行细胞煮沸；在实施方案中，在进行lamp步骤之前，对生物样品进行dna提取、煮沸、细胞煮沸或其任意组合。
5、在任一上述实施方案中，进行lamp包括优化mgso4浓度、温度和反应时间中的至少一种。在一些实施方案中，优化mgso4浓度包括6mm。在一些实施方案中，优化温度包括60℃。在一些实施方案中，优化反应时间包括60分钟。
6、在任一上述实施方案中，确定步骤比传统pcr灵敏至少100倍。
7、在任一上述实施方案中，确定步骤不检测包括以下的微生物中的任一种或多种：阴道毛滴虫、化脓性链球菌(s.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(e.coli)、粪肠球菌(e.faecalis)和白色念珠菌(c.albicans)。
8、在任一上述实施方案中，进行lamp的步骤包括使用表1所列的引物组(seq idnos:2-7)。
9、本文提供了检测口腔毛滴虫的方法，包括：制备用于检测的生物样品；对生物样品进行lamp；以及确定生物样品是否包含口腔毛滴虫。本文还提供了检测口腔毛滴虫的方法,包括：制备用于检测的生物样品；分析生物样品中是否存在口腔毛滴虫的核酸，例如dna或rna；以及确定生物样品中是否包含口腔毛滴虫。生物样品可以从合适的受试者获得，例如真核脊椎动物。在一些实施方案中,受试者是人类。在实施方案中，受试者是犬。
10、可以根据本文提供的方法的任何实施方案进行分析的生物样品包括但不限于血液、血浆、血清、尿液、唾液、精液(seminal fluid)、灌洗液(例如支气管肺泡灌洗液、胃灌洗液、腹膜灌洗液、导管灌洗液、耳灌洗液、关节镜灌洗液)、宫颈液、宫颈阴道液、脑脊液(cerebrospinal fluid)、阴道液、乳腺液、乳汁、滑膜液、精液(semen)、精液(seminalfluid)、痰液、脑脊液(cerebral spinal fluid)、泪液、粘液、间质液、卵泡液、羊水、房水、玻璃体液、腹腔液、腹水、汗液、淋巴液、肺痰或其级分或组分。在某些实施方案中，生物样品包括口腔拭子或唾液或尿液。
11、在本文提供的方法的任何实施方案中，可以在pbs中稀释生物样品。在具体实施方案中，在例如通过进行lamp分析dna步骤之前，既没有对生物样品进行dna提取，也没有进行细胞煮沸。在本文提供的方法的任何实施方案中，进行lamp包括优化mgso4浓度、优化温度和优化反应时间中的至少一种。在实施方案中，优化mgso4浓度为约或等于6mm。在某些实施方案中，优化温度约为或等于60℃。在某些实施方案中，优化反应时间为约或等于60分钟。
12、在本文提供的任何方法的某些实施方案中，当使用lamp执行确定生物样品是否包含口腔毛滴虫的步骤时，其灵敏度至少比传统pcr高100倍。
13、在本文提供的任何方法的实施方案中，确定生物样品是否包含口腔毛滴虫的步骤未检测到包括以下的微生物中的任一种或多种：阴道毛滴虫、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、e.coli、粪肠球菌和白色念珠菌。
14、在本文提供的任何方法的实施方案中，当确定生物样品是否包含口腔毛滴虫的步骤包括对生物样品中的核酸(例如dna或rna)进行lamp分析时，进行lamp的步骤包括使用表1所列的引物seq id nos:2-7。在本文提供的任一方法的实施方案中，当确定生物样品是否包含口腔毛滴虫的步骤包括对生物样品中的核酸(例如dna或rna)进行lamp分析时，进行lamp的步骤包括使用表1所列的引物seq id nos:2-7。
15、在本文提供的任何方法的实施方案中，当确定生物样品是否包含口腔毛滴虫的步骤包括通过使用引物对的扩增方法，例如通过pcr或rt-pcr(反转录pcr)，对生物样品中的核酸(例如dna或rna)进行分析时，进行扩增的步骤包括使用包含表1所列seq id no:6和seq id no:7的引物对。
16、本文提供了分析生物样品核酸的方法，包括：
17、在扩增条件下，使生物样品或从生物样品中获得的核酸与至少一种多核苷酸引物对接触，从而制备混合物；并分析混合物的核酸；其中：如果seq id no:1的子序列存在于生物样品的核酸中，则在扩增条件下，多核苷酸引物对与seq id no:1的子序列杂交。
18、本文还提供了制备核酸混合物的方法，包括：在扩增条件下，使生物样品或生物样品的核酸与至少一种多核苷酸引物对接触，从而制备混合物，其中：如果seq id no:1的子序列存在于生物样品的核酸中，则在扩增条件下，多核苷酸引物对与seq id no:1的子序列杂交。在某些实施方案中，该方法还包括分析混合物的核酸。
19、本文还提供了分析生物样品核酸的方法，包括：在扩增条件下，使生物样品或从生物样品中获得的核酸与至少一种多核苷酸引物对接触，从而生成一种或多种扩增产物；并分析扩增产物，其中：如果seq id no:1的子序列存在于生物样品的核酸中，则在扩增条件下，多核苷酸引物对与seq id no:1的子序列杂交。
20、本文还提供了从生物样品生成核酸扩增产物的方法，包括：在扩增条件下，使生物样品或从生物样品中获得的核酸与至少一种多核苷酸引物对接触，从而生成一种或多种扩增产物，其中：如果seq id no:1的子序列存在于生物样品的核酸中，则在扩增条件下，多核苷酸引物对与seq id no:1的子序列杂交。在某些实施方案中，该方法还包括分析扩增产物。
21、在本文提供的任何方法的实施方案中，分析核酸或在扩增条件下生成的扩增产物包括确定生物样品中是否存在口腔毛滴虫核酸。在某些实施方案中，如果确定生物样品中存在口腔毛滴虫核酸，则分析核酸或在扩增条件下生成的扩增产物还包括基于在扩增条件下生成的扩增产物的量来量化生物样品中口腔毛滴虫核酸的量。
22、在本文提供的任何方法的实施方案中，至少一种引物对的一个或两个引物选自与以下序列相同或基本上相同的序列：seq id no:1的序列，或seq id no:1的子序列，或seqid no:1的互补序列(complement)，或seq id no:1子序列的互补序列。在某些实施方案中，至少一种引物对的至少一条多核苷酸与seq id no:1的子序列或seq id no:1子序列的互补序列相同或基本上相同，其中seq id no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分或包含口腔毛滴虫its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。在实施方案中，至少一种多核苷酸引物对包含正向引物和反向引物。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸引物对包含seq id no:6和seq id no:7所示的序列。
23、在本文提供的任何方法的实施方案中，可以在扩增条件下(例如pcr或qpcr)使用单个引物对分析核酸。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在扩增条件下使植物样品的核酸与多种多核苷酸引物对接触。在一些实施方案中，该方法包括在扩增条件下使生物样品的核酸与一组环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,lamp)引物接触。在某些实施方案中，lamp引物包含一组包含seq id no:2至seq id no:7的多核苷酸的引物。
24、在本文提供的任何方法的实施方案中，基于对核酸或核酸扩增产物的分析，确定生物样品中是否存在口腔毛滴虫。在某些实施方案中，分析生物样品中的核酸或核酸扩增产物还包括量化核酸或核酸扩增产物。在一些实施方案中，基于对核酸或核酸扩增产物的量化，对生物样品中口腔毛滴虫的量进行量化。
25、本文还提供了用于确定生物样品中是否存在口腔毛滴虫和/或其量的方法，包括：在扩增条件下，使生物样品或生物样品的核酸与至少一种多核苷酸引物对接触，并扩增样品，从而制备扩增核酸混合物，其中，如果存在口腔毛滴虫，则至少一种多核苷酸引物对能够与口腔毛滴虫核酸的子序列或其互补序列特异性杂交；确定扩增核酸混合物中是否存在作为多核苷酸引物对扩增产物的至少一种扩增子是否存在和/或其量，从而确定生物样品中是否存在口腔毛滴虫和/或其量。在某些实施方案中，至少一种引物对的至少一条多核苷酸与seq id no:1的子序列或seq id no:1子序列的互补序列相同或基本上相同，其中seqid no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分或包含口腔毛滴虫its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。在实施方案中，至少一种多核苷酸引物对包含正向引物和反向引物。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸引物对包含seq id no:6和seq id no:7所示的序列。
26、本文还提供了检测生物样品中是否存在口腔毛滴虫的方法，包括：在扩增条件下使生物样品或生物样品的核酸与一组环介导等温扩增(lamp)引物接触，并分析所得的扩增产物，从而基于对扩增产物的分析，确定生物样品中是否存在口腔毛滴虫。在某些实施方案中，通过扩增seq id no:1的子序列或seq id no:1子序列的互补序列，获得作为扩增核酸混合物中扩增产物的至少一种扩增子。在实施方案中，seq id no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分或包含口腔毛滴虫its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。在某些实施方案中，环介导等温扩增(lamp)引物组含seq id no:2至seq id no:7所示的序列。
27、在本文提供的任何方法的实施方案中，通过扩增口腔毛滴虫基因组dna的子序列或其互补序列，获得作为扩增核酸混合物中扩增产物的至少一种扩增子。在本文提供的任何方法的某些实施方案中，通过扩增口腔毛滴虫rna或cdna的子序列或其互补序列，获得作为扩增核酸混合物中扩增产物的至少一种扩增子。
28、在本文提供的任何方法的实施方案中，扩增的口腔毛滴虫核酸的子序列、其部分或其互补序列或互补序列的部分部分与其他原生动物寄生虫或微生物/病原体核酸的任何子序列均不相同。在实施方案中，其他原生动物寄生虫或微生物/病原体选自阴道毛滴虫、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、e.coli、粪肠球菌和白色念珠菌中的一种或多种。在本文提供的任何方法的某些实施方案中，该方法特异性检测口腔毛滴虫核酸，而不检测其他原生动物寄生虫或微生物/病原体。在实施方案中，该方法特异性检测口腔毛滴虫核酸，而不检测选自阴道毛滴虫、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、e.coli、粪肠球菌和白色念珠菌中一种或多种的其他原生动物寄生虫或微生物/病原体。
29、在本文提供的任何方法的某些实施方案中，进行lamp的扩增条件包括mg2+盐，例如mgso4，据此mg2+浓度(mm)为约3mm至约12mm，例如约4mm至约10mm，或约5mm至约9mm，或约5mm至约7mm，或为约或等于3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm或12mm。在实施方案中，进行lamp的扩增条件包括约或等于6mm的mg2+浓度。
30、在本文提供的任何方法的某些实施方案中，进行lamp的扩增条件包括约55℃至约65℃的温度，例如约56℃至约64℃，或约57℃至约63℃，或约58℃至约62℃，或约59℃至约61℃，或为约或等于55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃。在实施方案中，进行lamp的扩增条件包括约或等于60℃的温度。
31、在本文提供的任何方法的某些实施方案中，进行lamp的扩增条件包括约25分钟至约90分钟的反应时间(分钟)，例如约30分钟至约85分钟，或约35分钟至约80分钟，或约40分钟至约75分钟，或约45分钟至约70分钟，或约55分钟至约65分钟，或为约或等于40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、60分钟、61分钟、62分钟、63分钟、64分钟或65分钟。在实施方案中，进行lamp的扩增条件包括约或等于60分钟的反应时间。
32、本文还提供了检测生物样品中是否存在口腔毛滴虫的方法，包括：在扩增条件下使生物样品或生物样品的核酸与一组环介导等温扩增(lamp)引物接触，其中环介导等温扩增(lamp)引物组包含seq id no:2至seq id no:7所示的序列，并且扩增条件包括约或等于6mm的mgso4浓度、约或等于60℃的温度和约或等于60分钟的反应时间，并分析所得到的扩增产物，从而基于对扩增产物的分析，确定生物样品中是否存在口腔毛滴虫。
33、在本文提供的任何方法的实施方案中，对核酸和/或由此衍生的扩增产物的分析，可以包括检测生物样品中是否存在口腔毛滴虫核酸，并且进一步，如果确定生物样品中存在口腔毛滴虫，则量化口腔毛滴虫核酸和/或由此衍生的扩增产物。核酸量化可以通过本领域技术人员已知的方法进行，包括但不限于定量pcr(qpcr)、逆转录酶qpcr(rt-qpcr)和定量lamp方法。
34、本文提供的方法所用的生物样品从受试者获得或之前已从受试者获得。在某些实施方案中，受试者可以是任何真核生物，包括但不限于脊椎动物、哺乳动物、人类和其他灵长类动物、猪、牛、猫、禽、马、犬和其他真核生物。在实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，受试者是犬。
35、可以根据本文提供的方法的任何实施方案进行分析的生物样品包括但不限于血液、血浆、血清、尿液、唾液、精液(seminal fluid)、灌洗液(例如支气管肺泡灌洗液、胃灌洗液、腹膜灌洗液、导管灌洗液、耳灌洗液、关节镜灌洗液)、宫颈液、宫颈阴道液、脑脊液(cerebrospinal fluid)、阴道液、乳腺液、母乳、滑膜液、精液(semen)、精液(seminalfluid)、痰液、脑脊液(cerebral spinal fluid)、泪液、粘液、间质液、卵泡液、羊水、房水、玻璃体液、腹腔液、腹水、汗液、淋巴液、肺痰或其级分或组分。在某些实施方案中，生物样品包括口腔拭子或唾液或尿液。
36、本文还提供了选择受试者以潜在治疗与口腔毛滴虫存在相关疾病的方法，包括根据本文提供的任何方法检测受试者的生物样品中是否存在口腔毛滴虫，如果在生物样品中检测到口腔毛滴虫，则选择受试者以潜在治疗疾病。在实施方案中，该方法还包括将受试者鉴定为患有与口腔毛滴虫存在相关疾病的受试者和/或治疗该疾病。在某些实施方案中，疾病是牙周病。在某些实施方案中，疾病是性传播疾病。
37、本文提供了用于进行本文所提供的任何方法的组合物。例如，本文提供了包含一种或多种多核苷酸引物对的组合物，其中：至少一种引物对的一个或两个引物选自与以下序列相同或基本上相同的序列：seq id no:1的序列，或seq id no:1的子序列，或seq idno:1的互补序列，或seq id no:1子序列的互补序列。在某些实施方案中，至少一种引物对的至少一条多核苷酸引物与seq id no:1的子序列或seq id no:1子序列的互补序列相同或基本上相同，其中seq id no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分部分或包含口腔毛滴虫its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。在实施方案中，至少一种多核苷酸引物对包含正向引物和反向引物。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸引物对包含seq id no:6和seq id no:7所示的序列。在实施方案中，组合物还包含用于复制和/或扩增靶核酸的试剂，例如，用于进行pcr或qpcr的试剂。
38、本文还提供了包含一组环介导等温扩增(lamp)引物的组合物，其中至少一种引物对的引物选自与以下序列相同或基本上相同的序列：seq id no:1的序列，或seq id no:1的子序列，或seq id no:1的互补序列，或seq id no:1子序列的互补序列。在某些实施方案中，至少一种引物对的至少一条多核苷酸与seq id no:1的子序列或seq id no:1子序列的互补序列相同或基本上相同，其中seq id no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分部分或包含口腔毛滴虫its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。在某些实施方案中，本文提供的组合物中的环介导等温扩增(lamp)引物组包含seq id no:2至seq id no:7所示的序列。在实施方案中，该组合物还包含用于对靶核酸进行lamp分析的试剂，例如缓冲液和镁盐。在某些实施方案中，镁盐是mgso4。
39、本文还提供了分离的多核苷酸，其包含或一条或多条用于检测口腔毛滴虫的多核苷酸，其中多核苷酸序列与以下序列相同或基本上相同：seq id no:1的序列，或seq idno:1的子序列，或seq id no:1的互补序列，或seq id no:1子序列的互补序列。在某些实施方案中，分离的多核苷酸的序列与seq id no:1的子序列或seq id no:1子序列的互补序列相同或基本上相同，其中seq id no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分或包含口腔毛滴虫its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。在实施方案中，分离的多核苷酸包含seq id no:2至seq id no:7所示的序列。
40、本文还提供了包含本文提供的任何组合物或分离的多核苷酸的试剂盒，以及用于分析口腔毛滴虫核酸的说明书。
1.分析来自生物样品的核酸的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，分析所述扩增产物包括确定所述扩增核酸混合物中是否存在至少一种扩增子，所述扩增子是所述组中的多核苷酸引物对的扩增产物，其中，如果存在所述扩增子，则确定口腔毛滴虫(t.tenax)存在于所述生物样品中，如果不存在所述扩增子，则确定口腔毛滴虫不存在于所述生物样品中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，至少一种多核苷酸引物对包含与seq id no:1的子序列或seq id no:1子序列的互补序列相同或基本上相同的序列，其中，seq id no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分或包含口腔毛滴虫的its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合，从而在扩增条件下生成包含seq id no:1子序列的扩增产物的扩增核酸混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述引物对的组包含环介导等温扩增(lamp)引物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述环介导等温扩增(lamp)引物包含seq id no:2-7所示的序列。
6.确定生物样品中是否存在口腔毛滴虫的方法，包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其中，分析所述扩增产物包括确定是否存在至少一种扩增子，所述扩增子是通过扩增seq id no:1的子序列或seq id no:1的子序列的互补序列获得的扩增产物，其中，seq id no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分或包含口腔毛滴虫的its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中，所述环介导等温扩增(lamp)引物的组包含seq id no:2-7所示的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述生物样品来自人受试者。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述生物样品来自犬受试者。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述扩增条件包括约6mm的mgso4浓度。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述扩增条件包括约60℃的反应温度。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述扩增条件包括约60分钟的反应时间。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述生物样品包括口腔拭子、唾液或尿液。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的方法，其中，如果包括阴道毛滴虫(t.vaginalis)、化脓性链球菌(s.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、大肠杆菌(e.coli)、粪肠球菌(e.faecalis)和白色念珠菌(c.albicans)的微生物中的一种或更多种存在于所述生物样品中，所述微生物不会被检测到。
16.根据权利要求2-15中任一项所述的方法，其中，确定所述生物样品中是否存在口腔毛滴虫的灵敏度比如果将所述生物样品或从所述生物样品获得的核酸在扩增条件下与传统pcr的引物对接触时高至少100倍。
17.组合物，包含环介导等温扩增(lamp)引物的组，所述组包含一种以上的多核苷酸引物对，其中，至少一种多核苷酸引物对的每条多核苷酸引物选自与下列序列相同或基本上相同的序列：seq id no:1的序列，或seq id no:1的子序列，或seq id no:1的互补序列，或seq id no:1的子序列的互补序列。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述至少一种引物对的至少一条多核苷酸与seq id no:1的子序列或seq id no:1的子序列的互补序列相同或基本上相同，其中，seqid no:1的子序列包含口腔毛滴虫的its区或其部分、口腔毛滴虫的5.8s rrna基因或其部分或包含口腔毛滴虫的its区和/或5.8s rrna基因的区域或其部分的任何组合。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的组合物，其中，所述环介导等温扩增(lamp)的组包含seq id no:2-7所示的序列。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的组合物，还包含用于进行lamp分析的试剂。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中，用于进行lamp分析的试剂包含缓冲液和mgso4。
22.试剂盒，包括权利要求17-21中任一项所述的组合物和用于分析生物样品中口腔毛滴虫核酸的说明。
