：本发明属于生物，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法。
背景技术
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背景技术：
1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，prrsv)引起的一种能够感染各年龄段猪的重要传染病，对世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。prrsv是动脉炎病毒科的单股正链rna病毒，基因组全长约15kb，可分为欧洲型prrsv(ⅰ型)和美洲型prrsv(ⅱ型)两种基因型。prrsv具有严格的宿主和组织细胞嗜性，主要感染家猪和野猪的单核细胞系，尤其是猪源的肺泡巨噬细胞(porcine alveolarmacrophage，pam)。prrsv基因组变异速度快，核苷酸取代率高达4.71×10-2～9.8×10-2·碱基·年，是已知变异速度最快的rna病毒之一。欧洲型prrsv和美洲型prrsv间仅共享约60％的核苷酸同源性、50％～80％的氨基酸同源性。prrsv基因组5’端有帽子结构，3’端有poly(a)尾，至少含12个开放阅读框(orfs)。orf1a和orf1b相关基因分别编码多蛋白pp1a和pp1ab，可以将其加工成16种非结构蛋白(nsp)，包括nsp1α/β，nsp2-6，nsp7α/β，nsp8-12以及nsp2tf和nsp2n。orf2a，orf2b和orfs3-7分别编码病毒结构蛋白，gp2a，gp3，gp4，gp5，m，n，gp5a。
2、prrsv反向遗传操作系统是近年来迅速发展的一项重要技术，作为载体平台而在多个研究领域发挥着重要作用，目前开展研究较多的方面主要包括：探究病毒的复制与调控过程、探究病毒蛋白翻译后修饰的意义、插入标记基因以实现病毒示踪、消除病毒引起的免疫抑制、鉴定prrsv的必须和非必须基因组区域、作为病毒载体平台、研究决定细胞嗜性的病毒因素、识别病毒毒力的决定因素、提高疫苗的安全性及免疫效果、表征病毒靶标以进行抗体的识别与结合等。
3、以prrsv为病毒载体嵌入外源基因的研究经历了一个较为漫长的过程，时至今日仍是一项具有挑战性的技术。nsp2基因是prrsv变异度最高的基因，许多prrsv分离株被报道缺失了nsp2区的部分序列，因此许多研究将nsp2作为外源基因嵌入的关键位点。此外，编码各结构蛋白基因之间的位置也是外源基因嵌入的合适靶标，然而prrsv属于嵌套病毒目，结构蛋白基因间大多彼此重叠，因此可供选择的嵌入位点较为有限。prrsv作为变异速度最快的rna病毒之一，是否具有开发为病毒载体的潜能关键在于其对嵌入外源基因的容载能力。目前已有许多研究尝试在prrsv病毒载体中嵌入外源基因，但是这些研究大多是在其中的一个位点嵌入的单个外源基因，且部分重组毒株往往会迅速丢失外源基因甚至无法拯救成功。例如在orf4和orf5a之间嵌入gfp基因，虽然获得的重组病毒具有复制能力，但是所述重组病毒仅在marc-145细胞中稳定传三代。此外，目前多数研究构建prrsv感染性克隆时仍采用将病毒全基因组划分为若干个小片段，之后利用“碱基互补配对原则”依靠传统的核酸内切酶和dna连接酶将小片段逐个连接的方式进行构建，如此构建方式效率缓慢，而将无缝克隆技术引入感染性克隆的构建可以显著提升构建效率。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法。采用如下技术方案：
2、猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，以猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株的传代弱毒株为亲本毒株，利用同源重组和反向遗传操作技术等基因工程手段构建感染性克隆质粒pbac-gd，经bhk21--marc-145真核转染拯救后得拯救毒株rgd。以感染性克隆pbac-gd为病毒载体，在其orf1与orf2a之间插入一个红色荧光标记基因和一个trs序列，得pbac-gd-mcherry感染性克隆质粒，拯救得表达红色荧光蛋白的重组毒株rprrsv-mcherry；在此基础上，在pbac-gd-mcherry感染性克隆质粒的orf7和3’utr之间再插入一个绿色荧光标记基因egfp和另一个trs序列，得pbac-gd-mcherry-egfp感染性克隆质粒，经拯救得同时表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的重组毒株rprrsv-mcherry-egfp。
3、具体包括以下内容：
4、第一方面，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株，所述重组毒株是在猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因，以及orf7和3’utr之间嵌入第二个标记基因获得。
5、优选地，所述重组毒株是在猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trs，以及orf7和3’utr之间嵌入猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trs和第二个标记基因获得；所述第一个标记基因和第二个标记基因不同；所述转录调控序列trs分别位于第一个标记基因3’末端和第二个标记基因5’末端。
6、优选地，所述orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsa，所述orf7和3’utr之间嵌入猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsb和第二个标记基因；所述trsa与trsb的基因序列分别如seq idno.1和seq id no.2所示。
7、优选地，所述第一个标记基因为红色荧光蛋白基因mcherry；所述第二个标记基因为绿色荧光蛋白基因egfp。
8、优选地，所述亲本毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株或以猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株传代后获得的弱毒珠。
9、第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株在筛选抗病毒药物或在制备基因工程疫苗中的应用。
10、优选地，所述疫苗包括单苗、联合疫苗、活疫苗或灭活疫苗。
11、优选地，所述疫苗包括基因工程疫苗。
12、第三方面，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，所述方法为：
13、通过基因工程手段在猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trs，以及orf7和3’utr之间嵌入猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trs和第二个标记基因获得插入双基因标记的重组prrsv病毒；所述第一个标记基因和第二个标记基因不同；所述转录调控序列trs分别位于第一个标记基因3’末端和第二个标记基因5’末端。
14、优选地，所述orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsa，所述orf7和3’utr之间嵌入猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsb和第二个标记基因；所述trsa与trsb的基因序列分别如seq idno.1和seq id no.2所示。
15、优选地，所述第一个标记基因为红色荧光蛋白基因mcherry；所述第二个标记基因为绿色荧光蛋白基因egfp。
16、优选地，所述亲本毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株或以猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株传代后获得的弱毒珠。
17、优选地，所述方法包括以下步骤：
18、(1)构建亲本毒株感染性克隆质粒；
19、(2)将由trs和红色荧光蛋白mcherry组成的基因序列嵌入到步骤(1)所述感染性克隆质粒中的orf1-orf2a之间，获得感染性克隆质粒；
20、(3)将由trs和绿色荧光蛋白egfp组成的基因序列嵌入到步骤(2)所述感染性克隆质粒中的orf7和3’utr之间，获得感染性克隆质粒；
21、(4)将步骤(3)所述的感染性克隆质粒转染bhk21细胞后转接marc-145细胞进行拯救，获得双基因标记的重组毒株。
22、第四方面，本发明提供了一种根据上述第三方面所述方法制备获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株。
23、第五方面本发明提供了一种上述第四方面所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株在筛选抗病毒药物或在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用。
24、优选地，所述疫苗包括单苗、联合疫苗、活疫苗或灭活疫苗。
25、优选地，所述疫苗包括基因工程疫苗。
26、本发明的有益效果是：prrs是危害全球养猪业最重要的动物传染病之一，且prrs是一种免疫抑制性疾病，易继发其他细菌或病毒性疾病而加剧对猪的危害，如猪瘟、圆环等。因此，以prrsv感染性克隆质粒为病毒载体，嵌入猪瘟、猪圆环等病毒的基因组而开发能对其提供充足交叉保护的嵌合疫苗是prrs等猪病防控的重要手段。据此，本发明构建了prrsv弱毒株gd的感染性克隆，在此基础上利用同源重组等基因工程手段在其orf1和orf2a之间嵌入红色荧光蛋白基因mcherry，在其orf7与3’utr基因间嵌入绿色荧光蛋白基因egfp，得同时表达红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组prrsv毒株。与现有技术相比，本发明公开的借助同源重组技术构建重组prrsv毒株的方法更加方便快捷；此外，本发明首次实现了在prrsv基因组的orf1和orf2a之间、orf7与3’utr之间同时嵌入两个不同的外源荧光蛋白基因，且rt-pcr、ifa和wb等结果显示插入的两外源荧光标记基因遗传稳定且两外源蛋白稳定表达。激光共聚焦结果显示两外源蛋白与prrsv n蛋白存在共定位，流式细胞术结果显示mcherry和egfp双阳性细胞数随prrsv感染时间延长而逐渐增多。本发明为实现prrsv的可视化失踪、研制prrsv基因工程疫苗和多联多价疫苗等奠定了基础。
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株，其特征在于，所述重组毒株是在猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trs，以及orf7和3’utr之间嵌入猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trs和第二个标记基因获得；所述第一个标记基因和第二个标记基因不同；所述转录调控序列trs分别位于第一个标记基因3’末端和第二个标记基因5’末端。
2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株，其特征在于，所述orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsa，orf7和3’utr之间嵌入猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsb和第二个标记基因；所述trsa与trsb的基因序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
3.如权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株，其特征在于，所述第一个标记基因为红色荧光蛋白基因mcherry；所述第二个标记基因为绿色荧光蛋白基因egfp。
4.如权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株，其特征在于，所述亲本毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株或以猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株传代后获得的弱毒珠。
5.如权利要求1-4任一所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株在筛选抗病毒药物或在制备基因工程疫苗中的应用。
6.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于，所述方法为：
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述orf1和orf2a之间嵌入第一个标记基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsa，orf7和3’utr之间嵌入猪繁殖与呼吸综合征病毒亲本毒株的转录调控序列trsb和第二个标记基因；所述trsa与trsb的基因序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述第一个标记基因为红色荧光蛋白基因mcherry；所述第二个标记基因为绿色荧光蛋白基因egfp。
9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述亲本毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株或以猪繁殖与呼吸综合征病毒gd分离株传代后获得的弱毒珠。
10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
