本发明属于基因工程，具体涉及具有止血性能的重组胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
1、胶原蛋白(collagen)作为细胞外基质的主要成分，广泛分布于各种动物体内，占动物体总蛋白质量的最高比例。陆生动物体内的胶原蛋白约占总蛋白质量的25％。作为一种主要的结构蛋白，胶原蛋白在动物的皮肤、骨骼、软骨等组织中发挥着关键的支撑作用。胶原蛋白主要来源于动物组织，天然提取的胶原蛋白是由多种不同分子量的胶原蛋白组成的混合物，其不溶于水且生物相容性较差，此外，由于这些胶原蛋白来源于动物组织，因此存在动物源疾病或者人传染疾病交叉感染的风险，同时，由于不同物种之间的差异，这些天然提取的胶原蛋白不能与人体完全相容，可能导致免疫排斥和过敏反应。
2、传统的胶原蛋白生产方法通常是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，以提取胶原蛋白衍生物。然而，这些方法提取的胶原蛋白已经丧失了原本的生物学活性，无法在生物医学领域中发挥其真正的功能。随着合成生物学的发展，利用基因工程技术生产重组人源化胶原蛋白的技术日趋成熟。通过这种方法生产的重组胶原蛋白具有高产量、低免疫反应和高活性的优点，大大扩大了其在医学领域中的应用前景。
3、重组胶原蛋白在氨基酸组成、生物安全性和生物活性方面具有显著优势，使其在医学应用领域受到广泛关注和研究。目前，研究主要集中在骨修复材料、皮肤修复材料和止血材料等方面。其中在止血材料方面，重组胶原蛋白的高生物相容性和快速凝血能力使其成为一种理想的止血材料。在医学应用领域，如何快速有效止血一直是广大医护和科研工作者努力的方向。目前常见的止血材料主要是通过外力压迫性止血。经过多年的临床验证，海藻酸盐和壳聚糖的止血能力和效果已经被广泛接受。动物源性胶原蛋白的止血材料也在临床中被大量应用，但重组胶原蛋白止血材料大多数尚在研究和测试阶段。
4、重组胶原蛋白在止血方面的应用前景广阔。由于其高生物相容性和低免疫反应，重组胶原蛋白能够提供一种安全有效的止血手段。此外，重组胶原蛋白具有良好的粘附性和优异的内源性止血性能，这使其在临床应用中具有独特的优势。因此，开发具有止血速度快，粘附性好，生物相容性好、内源性止血性能要优异止血胶原蛋白材料以满足日益紧迫的临床需求显得尤为重要。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供具有止血性能的重组胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明的重组胶原蛋白具有可结合α2β1以黏附血小板的功能，以及可结合gpⅵ以活化血小板的功能，具有止血速度更快，止血效果更佳的特点。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种具有止血性能的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列包括seq id no.1所示的氨基酸序列。
3、上述的具有止血性能的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列包括i或ii；
4、i将上述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有人胶原蛋白活性的氨基酸序列；
5、ii将上述氨基酸序列经一个或多个片段重复得到的具有人胶原蛋白活性的氨基酸序列。
6、上述的具有止血性能的重组胶原蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列为seq idno.2。
7、此外，本发明还提供一种制备具有止血性能的重组胶原蛋白的方法，其特征在于，包括：将上述的重组胶原蛋白的核酸分子的表达载体和包含人源脯氨酸-4-羟化酶的核酸分子的表达载体转入感受态细胞进行共表达。
8、上述的方法，其特征在于，包含人源脯氨酸-4-羟化酶的核酸分子的表达载体中所用质粒为p4hα-p4hβ重组质粒、p4hα重组质粒和p4hβ重组质粒中的一种或多种。
9、上述的方法，其特征在于，所述感受态细胞为毕赤酵母gs115感受态细胞。
10、一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为可供编码如权利要求1～3任一权利要求所述具有止血性能的重组胶原蛋白的核酸分子。
11、本发明还提供一种重组表达载体，其特征在于，包括上述核酸分子。
12、本发明还提供一种宿主细胞，其特征在于，包括上述核酸分子或上述重组表达载体。
13、进一步的，本发明还提供一种上述的具有止血性能的重组胶原蛋白在制备止血产品中的应用。
14、本发明与现有技术相比具有以下优点：
15、1、本发明提供一种具有止血性能的重组胶原蛋白，为人ⅲ型胶原蛋白α1片段，经研究发现，该片段与已被证实具有止血性能的牛三型胶原α1链的cb4片段具有高度相似性，其所具有的gpp氨基酸序列为可与糖蛋白ⅵ结合以活化血小板的氨基酸位点。
16、2、本发明还以上述人ⅲ型胶原蛋白α1片段为基础，将无规则卷曲位点替换为gfpger氨基酸序列，且gpp位点与gfpger位点位于同一片段，得到可结合α2β1以黏附血小板、且可同时进行血小板活化和黏附聚集血小板的重组胶原蛋白，其止血速度更快，止血效果更佳。
17、3、本发明还提供一种得到具有止血性能的重组胶原蛋白的方法，利用基因工程技术构建重组胶原蛋白与人源脯氨酸4-羟化酶(p4h)在毕赤酵母中共表达，实现无规则卷曲位点的替换，具有表达率更高、止血性能更好的特点。
18、4、优选的，本发明的重组胶原蛋白的制备方法，通过不同培养基的配合以及发酵条件的优化，实现羟基化重组胶原蛋白的高效分泌表达，产量可达5.2g/l。
19、5、本发明的重组胶原蛋白的制备方法，产物具有更加优良的止血和凝血效果，在细胞毒性或溶血方面具有更高的安全性，且产量高，成本低，有利于产业化推广。
20、下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
21、说明书附图
22、图1为实施例1上清液中蛋白的电泳图。
23、图2为实施例1具有止血性能的重组胶原蛋白的电泳图。
24、图3为实施例2的胶原蛋白止血海绵的组织相容性测试结果。
25、图4为实施例2的胶原蛋白止血海绵的止血性测试结果。
26、图5为实施例2的胶原蛋白止血海绵的血细胞黏附性和血小板黏附性测试结果。
27、图6为实施例2的胶原蛋白止血海绵的对血小板的活化能力测试结果。
1.一种具有止血性能的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列包括seq id no.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的具有止血性能的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列包括i或ii；
3.根据权利要求2所述的具有止血性能的重组胶原蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列为seq id no.2。
4.一种制备具有止血性能的重组胶原蛋白的方法，其特征在于，包括：将包含权利要求1～3任一权利要求所述的重组胶原蛋白的核酸分子的表达载体和包含人源脯氨酸-4-羟化酶的核酸分子的表达载体转入感受态细胞进行共表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包含人源脯氨酸-4-羟化酶的核酸分子的表达载体中所用质粒为p4hα-p4hβ重组质粒、p4hα重组质粒和p4hβ重组质粒中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述感受态细胞为毕赤酵母gs115感受态细胞。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为可供编码如权利要求1～3任一权利要求所述具有止血性能的重组胶原蛋白的核酸分子。
8.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求7所述核酸分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求7所述核酸分子或权利要求8所述重组表达载体。
10.一种如权利要求1～3任一权利要求所述的具有止血性能的重组胶原蛋白在制备止血产品中的应用。
